Pestycydy odgrywają kluczową rolę w rozwiązywaniu globalnych niedoborów żywności i zwalczaniu chorób przenoszonych przez wektory. Jednak narastający problem oporności na pestycydy pilnie wymaga odkrycia nowych związków, które będą oddziaływać na niewykorzystane dotąd cele. Kanały receptora przejściowego potencjału owadów (TRPV) – Nanzhong (Nan) i nieaktywny (Iav) – mogą tworzyć kanały heterologiczne (Nan-Iav) i lokalizować się w narządach mechanosensorycznych, które pośredniczą w geotropizmie, słyszeniu i propriocepcji u owadów. Niektóre pestycydy, takie jak afidopirolidon (AP), oddziałują na Nan-Iav poprzez nieznane mechanizmy. AP jest skuteczny przeciwko owadom kłująco-ssącym (pluskwiakom), uniemożliwiając im żerowanie poprzez zaburzanie funkcji włókienek. AP może wiązać się tylko z Nan, ale tylko Nan-Iav może oddziaływać z agonistami, w tym endogennym nikotynamidem (NAM), wykazując w ten sposób aktywność kanałową. Pomimo potencjału Nan-Iav jako celu dla insektycydów, niewiele wiadomo na temat budowy kanałów, regulacyjnych miejsc wiązania i regulacji zależnej od Ca2+, co utrudnia dalszy rozwój insektycydów. W niniejszym badaniu wykorzystano kriomikroskopię elektronową do określenia struktury Nan-Iav u owadów Hemiptera w stanie wolnym od kalmoduliny i ligandu, a także z AP i NAM na granicy domeny cytoplazmatycznej powtórzeń ankiryny (ARD). Ku naszemu zaskoczeniu odkryliśmy, że samo białko Nan może tworzyć pentamer, który jest stabilizowany przez interakcje ARD za pośrednictwem AP. Niniejsze badanie ujawnia interakcje molekularne między insektycydami i agonistami a Nan-Iav, podkreślając znaczenie ARD w funkcjonowaniu i budowie kanałów oraz badając mechanizm regulacji Ca2+.
W obliczu coraz poważniejszej globalnej zmiany klimatu pogarszające się bezpieczeństwo żywnościowe na świecie stanowi jedno z największych wyzwań XXI wieku, niosące za sobą daleko idące konsekwencje dla społeczeństwa.1,2W raporcie Światowej Organizacji Zdrowia pt. „Stan bezpieczeństwa żywnościowego i żywienia na świecie w 2023 r.” (SOFI) oszacowano, że na całym świecie około 2,33 miliarda ludzi zmaga się z umiarkowanym lub poważnym niedoborem żywności, co stanowi problem istniejący od dawna.3,4Niestety szacuje się, że co roku z powodu szkodników i patogenów tracimy od 20% do 30% plonów, a globalne ocieplenie prawdopodobnie jeszcze bardziej zwiększy odporność upraw na szkodniki i ich podatność na choroby.4,5,6,7,8Rozwój pestycydów ma kluczowe znaczenie nie tylko ze względu na ochronę upraw przed szkodnikami i ograniczenie rozprzestrzeniania się patogenów przenoszonych przez wektory, ale także ze względu na walkę z chorobami przenoszonymi przez wektory, takimi jak denga, malaria i choroba Chagasa, które stają się coraz bardziej odporne na pestycydy.5,9,10,11
Spośród głównych celów neurotoksycznych insektycydów heterotetrameryczny kanał TRPV Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) reprezentuje klasę celów insektycydów odkrytych dopiero w ostatniej dekadzie, obejmującą dostępne w handlu insektycydy, takie jak imidakloprid i pyraklostrobina.12,13,14Półsyntetyczny insektycyd aphidopyrolifen (AP) to niedawno opracowany i wprowadzony na rynek produkt, którego głównym składnikiem jest aktywny insektycyd Inscalis®, wiążący AP na poziomie aktywności subnanomolarnej.15AP wykazuje niską ostrą toksyczność dla zapylaczy, owadów pożytecznych i innych organizmów niebędących przedmiotem zwalczania, a jeśli jest stosowany zgodnie z instrukcją na etykiecie, może zmniejszyć presję oporności na inne insektycydy.16,17,18Nan i Iav są szeroko rozpowszechnione wśród gatunków owadów, współwystępują tylko w neuronach receptorowych rozciągania strunowego czułków i kończyn oraz odgrywają istotną rolę w słyszeniu, postrzeganiu grawitacji i propriocepcji.13,16,19,20,21,22AP, imidakloprid i piraklostrobina stymulują kompleks Nan-Iav poprzez unikalny mechanizm, ostatecznie hamując przekazywanie sygnału proprioceptywnego.13,16,23U owadów kłująco-ssących (hemipteranów), takich jak mszyce i mączliki, utrata propriocepcji upośledza ich zdolność do pobierania pokarmu, co ostatecznie prowadzi do śmierci.13,24Co ciekawe, AP wykazuje wysokie powinowactwo do kompleksu Nan-Iav i niskie powinowactwo do samego Nan. Wiązanie AP z Nan-Iav indukuje przepływ prądu elektrycznego, ale wiązanie z samym Nan nie stymuluje aktywności kanału. Sam Iav w ogóle nie wiąże się z AP.16Sugeruje to, że Nan i Iav mogą wiązać się, tworząc różne kompleksy kanałów Nan-Iav (np. o różnych stosunkach stechiometrycznych lub różnym ułożeniu w ramach tego samego stosunku stechiometrycznego) lub że AP może wiązać się z wieloma miejscami. Co więcej, naturalny agonista, nikotynamid (NAM), wiąże się z Nan-Iav Drosophila z powinowactwem mikromolarnym, wykazując działanie podobne do działania mszyc (AP) in vitro.16,25i hamując rozmnażanie i żerowanie mszyc, co ostatecznie prowadzi do ich śmierci25,26Dane te rodzą wiele pytań. Na przykład, nadal nie jest jasne, jak powstaje heterodimer Nan-Iav, które miejsca wiązania są wykorzystywane do modulacji małych cząsteczek oraz w jaki sposób te małe cząsteczki regulują funkcję kanału poprzez hamowanie propriocepcji. Co więcej, przyczyny, dla których sam Nan jest nieaktywny i ma niskie powinowactwo do receptora AP, podczas gdy heterodimer Nan-Iav jest aktywny i wiąże receptor AP z wyższym powinowactwem, pozostają niejasne. Wreszcie, niewiele wiadomo na temat zależnej od Ca2+ regulacji funkcji Nan-Iav i jej integracji z procesami sygnalizacji neuronalnej.. 13,21
W niniejszym badaniu, łącząc kriomikroskopię elektronową, elektrofizjologię i techniki wiązania radioligandu, wyjaśniliśmy budowę Nan-Iav oraz mechanizm jego wiązania z regulatorami małocząsteczkowymi. Ponadto wykryliśmy konstytutywnie związaną kalmodulinę (CaM) z Iav i pentamerami Nan stabilizowanymi AP. Wyniki te dostarczają istotnych informacji na temat regulacji jonów wapnia w kanałach, budowy kanałów oraz czynników determinujących powinowactwo wiązania ligandu. Co ważniejsze, potwierdziliśmy, że ARD odgrywa kluczową rolę w tych procesach. Nasze badanie kompletnych kanałów owadzich związanych z odpowiednimi pestycydami rolniczymi27, 28, 29otwiera perspektywy rozwoju przemysłu pestycydów, zwiększając skuteczność i specyficzność pestycydów oraz umożliwiając stosowanie związków ukierunkowanych na TRPV w odniesieniu do innych gatunków w celu rozwiązania problemu globalnego bezpieczeństwa żywnościowego i zapobiegania rozprzestrzenianiu się chorób przenoszonych przez wektory.
Stwierdziliśmy również, że kanał Nan-Iav jest regulowany przez Ca2+, a mechanizm regulacji jest pośredniczony przez konstytutywnie związany CaM. Co ważne, ta zależna od Ca2+ regulacja kanału Nav przez CaM znacząco różni się od mechanizmów regulacji innych kanałów jonowych (np. kanałów Na+ bramkowanych napięciem i kanałów TRPV5/6).52,53,54,55,56,57W kanale Nav1.2 domena C-końcowa CaM łączy się helisą z domeną C-końcową (CTD), a Ca2+ indukuje wiązanie jej domeny N-końcowej z dystalną częścią CTD56W kanale TRPV5/6 domena C-końcowa CaM wiąże się z CTH, a Ca2+ indukuje wydłużenie jej domeny N-końcowej w górę do poru, blokując w ten sposób przepuszczalność kationów53,54Proponujemy model funkcji Nan-Iav-CaM regulowanej przez Ca2+ (rys. 4h). W tym modelu domena N-końcowa CaM konstytutywnie wiąże się z domeną C-końcową (CTH) Iav. W stanie spoczynku (niskie stężenie [Ca2+]) domena C-końcowa CaM oddziałuje z Nan, stabilizując konformację ARD i tym samym promując otwarcie kanału. Wiązanie agonisty/insektycydu do kanału indukuje otwarcie poru, co prowadzi do napływu Ca2+. Ca2+ wiąże się następnie z CaM, powodując dysocjację domeny C-końcowej od ARD Nan. Ponieważ blokowanie wiązania CaM zasadniczo znosi hamujący wpływ Ca2+, ta dysocjacja moduluje ruchliwość ARD, powodując w ten sposób zależne od Ca2+ hamowanie lub desensytyzację. Szybka regeneracja prądów kanałowych po elucji jonów wapnia (ryc. 4g) sugeruje, że mechanizm ten ułatwia szybką odpowiedź na sygnały neuronalne pośredniczone przez Ca2+. Co więcej, doniesiono, że region C-końcowy Iav, który nadal jest słabo poznany, odgrywa inne role w kierowaniu kanałem i regulacji prądu.21
Wreszcie, nasze badanie prezentuje wysokorozdzielczą strukturę kompleksu kanałów TRP insektycyd-insektycyd o znaczeniu rolniczym – odkrycie dotychczas dla nas nieznane. Co istotne, scharakteryzowaliśmy strukturę i funkcję kanału owadziego w komórkach ludzkich (HEK293S GnTi–), a nie w komórkach owadzich. W obliczu rosnącej oporności na insektycydy i ciągłej presji na bezpieczeństwo żywnościowe i patogeny, nasza praca dostarcza istotnych informacji, które ułatwią rozwój nowych insektycydów z korzyścią dla zdrowia ludzi i globalnego bezpieczeństwa żywnościowego. Badania wykazały, że insektycydy, takie jak AP, są skuteczne przeciwko niektórym szkodnikom, jeśli są stosowane zgodnie z instrukcją na etykiecie, i charakteryzują się niską toksycznością ostrą dla pożytecznych zapylaczy, co świadczy o ich bezpieczeństwie dla środowiska.13,16Co więcej, testy niektórych pochodnych AP na komarach wykazały, że z czasem tracą one zdolność do lotu. Zrozumienie, w jaki sposób te związki modulujące wiążą się z Nan-Iav, ułatwi modyfikację istniejących związków lub opracowanie nowych, aby zapewnić skuteczniejsze i skuteczniejsze działanie.dokładnyZwalczanie szkodników. Nasze badanie pokazuje, że interfejs Nan-Iav ARD ma kluczowe znaczenie nie tylko dla regulacji aktywności związków endogennych, pestycydów i Ca2+-CaM, ale także dla budowy kanałów. Sugerujemy, że zakłócanie budowy heterodimerów za pomocą małych cząsteczek może być unikalnym i obiecującym podejściem w opracowywaniu inhibitorów kanałów jonowych.
Spośród ośmiu ortologicznych genów wybrano pełnej długości geny chrząszcza brunatnego (Halyomorpha halys) Nanchung i Inactive, wykazujące doskonałą stabilność w detergentach. Zsyntetyzowane geny zoptymalizowano pod kątem kodonów ekspresji u ludzi i sklonowano do wektora pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) z wykorzystaniem miejsc restrykcyjnych XhoI i EcoRI. Zapewniło to zgodność klonów z C-końcowymi znacznikami GFP-FLAG-10xHis i mCherry-FLAG-10xHis, które są rozszczepiane przez proteazę HRC-3C (PPX), umożliwiając niezależnewyrażenieDo klonowania genów Nanchung i Inactive do wektora pBacMam użyto następujących starterów:
Obrazy mikroskopowe poszczególnych cząstek uzyskano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego Titan Krios G2 (FEI) wyposażonego w kamerę K3 i filtr energetyczny Gatan BioQuantum. Mikroskop pracował przy napięciu 300 keV, energii ustawionej na 20 eV, rozmiarze piksela próbki 1,08 Å/piksel (nominalne powiększenie 81 000x) i gradiencie rozogniskowania od -0,8 do -2,2 μm. Nagranie wideo wykonano z prędkością 40 klatek na sekundę za pomocą mikroskopu Latitude S (Gatan) o nominalnej mocy dawki promieniowania 25 e–px−1 s−1, czasie ekspozycji 2,4 s i całkowitej dawce około 60 e–Å−2.
Korektę ruchu wywołanego wiązką promieniowania i ważenie dawki przeprowadzono na filmie za pomocą MotionCor2 w programie RELION 4.061. Estymację parametru funkcji przenoszenia kontrastu (CTF) przeprowadzono w programie cryoSPARC, stosując metodę estymacji CTF opartą na łatkach62. Fotomikrografie o rozdzielczości dopasowania CTF ≥4 Å wyłączono z dalszej analizy. Zazwyczaj do selekcji punktów w programie cryoSPARC wykorzystywano podzbiór 500–1000 fotomikrografii, a następnie po filtrowaniu przeprowadzano kilka rund klasyfikacji 2D w celu uzyskania wyraźnego obrazu odniesienia do selekcji cząstek na podstawie szablonu. Następnie cząstki ekstrahowano za pomocą 64-pikselowych pól ograniczających i 4-krotnego binowania. Przeprowadzono kilka rund klasyfikacji 2D w celu usunięcia niepożądanych kategorii cząstek. Początkowy model 3D zrekonstruowano metodą ab initio i udoskonalono metodą nierównomiernego udoskonalenia w programie cryoSPARC. Klasyfikację 3D przeprowadzono w CryoSPARC lub RELION w oparciu o heterogeniczność ARD. Nie zaobserwowano istotnej heterogeniczności domen błonowych. Cząstki udoskonalono metodami C1 i C2; cząstki o wyższej rozdzielczości C2 uznano za symetryczne względem C2 i zaimportowano do RELION w celu udoskonalenia bayesowskiego. Następnie cząstki przeniesiono z powrotem do CryoSPARC w celu ostatecznego udoskonalenia nierównomiernego i lokalnego. Końcową rozdzielczość i liczbę cząstek przedstawiono w tabeli 1.
Podczas przetwarzania pentamerów Nan+AP, badaliśmy różne metody poprawy rozdzielczości domen błonowych (zwłaszcza obszaru porów), takie jak odejmowanie sygnału i maskowanie TMD. Jednak próby te zakończyły się niepowodzeniem ze względu na potencjalnie skrajny nieporządek w obszarze porów i ogólną heterogeniczność TMD. Ostateczną rozdzielczość obliczono za pomocą maski generowanej automatycznie przez metodę przetwarzania nierównomiernego w programie CryoSPARC, ukierunkowaną przede wszystkim na obszar ARD. Pozwoliło to uzyskać znacznie wyższą rozdzielczość niż w przypadku domen błonowych (zwłaszcza obszaru VSLD).
Wstępne modele de novo form apo mikroorganizmów Nanchung i Inactive zostały wygenerowane za pomocą Coot63, a modele mikroorganizmów Nan i Iav za pomocą AlphaFold264 w celu identyfikacji regionów o niskiej ufności. Modelowanie kalmoduliny oparto na dopasowaniu ciał sztywnych modeli wiążących Ca2+ i wolnych od Ca2+ odpowiednio w akcesjach PDB 4JPZ56 i 1CFD65. Modele udoskonalono za pomocą udoskonalenia sferycznego, aby zapewnić poprawną stereochemię i dobrą geometrię. Następnie fosfatydylocholinę, fosfatydyloetanoloaminę i fosfatydyloserynę zamodelowano jako dobrze zdefiniowane gęstości lipidowe, a ligandy NAM i AP umieszczono w odpowiednich gęstościach w ścisłych połączeniach. Pliki ograniczeń wygenerowano z ciągu SMILES izoform za pomocą eLBOW w PHENIX66. Na koniec modele udoskonalono w przestrzeni rzeczywistej w oprogramowaniu PHENIX, wykorzystując lokalne przeszukiwanie siatki i globalną minimalizację z ograniczeniami struktury drugorzędowej. Do udoskonalenia modelu i analizy strukturalnej wykorzystano serwer MolProbity, a ilustracje wykonano za pomocą oprogramowania PyMOL i UCSF Chimera X. 67,68,69 Analizę apertury przeprowadzono za pomocą serwera HOLE70, a mapowanie zachowania sekwencji za pomocą serwera Consurf71.
Analizę statystyczną przeprowadzono z użyciem oprogramowania Igor Pro 6.2, Excel Office 365 oraz GraphPad Prism 7.0. Wszystkie dane ilościowe przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy (SEM). Do porównania dwóch grup zastosowano test t-Studenta (dwustronny, niezależny). Do porównania wielu grup zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Dunnetta. *P< 0,05, **P< 0,01 i ***PWartości < 0,001 uznano za statystycznie istotne w zależności od rozkładu danych. Wartości Kd, Ki i ich asymetryczne 95% przedziały ufności obliczono za pomocą programu GraphPad Prism 10.
Więcej szczegółów na temat metodologii badania można znaleźć w streszczeniu raportu Nature Portfolio Report, do którego link znajduje się w tym artykule.
Pierwotny model zbudowano z wykorzystaniem modeli kalmoduliny z baz danych PDB 4JPZ i 1CFD. Współrzędne zostały zdeponowane w Protein Data Bank (PDB) pod numerami akcesyjnymi 9NVN (Nan-Iav-CaM bez ligandu), 9NVO (Nan-Iav-CaM związany z nikotynamidem), 9NVP (Nan-Iav-CaM związany z nikotynamidem i EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM związany z afenidolopiroliną i wapniem), 9NVR (Nan-Iav-CaM związany z afenidolopiroliną i EDTA) oraz 9NVS (pentamer Nan związany z afenidolopiroliną). Odpowiednie obrazy kriomikroskopii elektronowej są zdeponowane w Bazie Danych Mikroskopii Elektronowej (EMDB) pod następującymi numerami akcesyjnymi: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM bez ligandu), EMD-49845 (kompleks Nan-Iav-CaM z nikotynamidem), EMD-49846 (kompleks Nan-Iav-CaM z nikotynamidem i EDTA), EMD-49847 (kompleks Nan-Iav-CaM z afidopiroliną i wapniem), EMD-49848 (kompleks Nan-Iav-CaM z afidopiroliną i EDTA) oraz EMD-49849 (kompleks pentameru Nan z afidopiroliną). W niniejszym artykule przedstawiono surowe dane do analizy funkcjonalnej.
Czas publikacji: 28-01-2026