Niniejsze badanie wykazuje, że symbiotyczny grzyb ryzosferowy *Kosakonia oryziphila* NP19 wyizolowany z korzeni ryżu jest obiecującym biopestycydem wspomagającym wzrost roślin i biopestycydem do zwalczania zarazy ryżu wywoływanej przez *Pyricularia oryzae*. Eksperymenty in vitro przeprowadzono na świeżych liściach sadzonek ryżu jaśminowego odmiany Khao Dawk Mali 105 (KDML105). Wyniki pokazały, że NP19 skutecznie hamował kiełkowanie zarodników *Pyricularia oryzae*. Zakażenie *Pyricularia oryzae* zostało zahamowane w trzech różnych warunkach zabiegu: najpierw ryż skolonizowano NP19 i zaszczepiono zarodnikami *Pyricularia oryzae*; po drugie, na liście naniesiono mieszaninę NP19 i zarodników *Pyricularia oryzae*;
Bakteria ryzosferowa *Kosakonia oryziphila* NP1914został wyizolowany z korzeni ryżu (*Oryza sativa* L. cv. RD6). *Kosakonia oryziphila* NP19 ma właściwości wspomagające wzrost roślin, w tym wiązanie azotu, produkcję kwasu indolilooctowego (IAA) i rozpuszczanie fosforanów. Co ciekawe, *Kosakonia oryziphila* NP19 produkuje chitynazę.14.Zastosowanie *Kosakonia oryziphila* NP19 na nasionach ryżu odmiany KDML105 poprawiło przeżywalność ryżu po zakażeniu zarazą ryżu. Celem niniejszego badania jest (i) wyjaśnienie mechanizmu hamującego działanie *Kosakonia oryziphila* NP19 na zarazę ryżu oraz (ii) zbadanie wpływu *Kosakonia oryziphila* NP19 na zwalczanie zarazy ryżu.
Składniki odżywcze odgrywają kluczową rolę we wzroście i rozwoju roślin, pełniąc funkcję czynników kontrolujących różne choroby mikrobiologiczne. Odżywianie mineralne rośliny determinuje jej odporność na choroby, cechy morfologiczne lub tkankowe oraz wirulencję, czyli zdolność do przetrwania w starciu z patogenami. Fosfor może spowolnić rozwój i złagodzić przebieg zarazy ryżu poprzez zwiększenie syntezy związków fenolowych. Potas generalnie zmniejsza występowanie wielu chorób ryżu, takich jak zaraza ryżu, bakteryjna plamistość liści, plamistość pochwy liściowej, zgnilizna łodygi i plamistość liści. Badanie Perrenouda wykazało, że nawozy bogate w potas mogą również zmniejszać występowanie chorób grzybowych ryżu i zwiększać plony. Liczne badania wykazały, że nawozy siarkowe mogą poprawiać odporność upraw na patogeny grzybowe.27Nadmiar magnezu (składnika chlorofilu) może powodować chorobę ryżu.21Cynk może bezpośrednio zabijać patogeny, tym samym zmniejszając nasilenie choroby.22Badania terenowe wykazały, że chociaż stężenia fosforu, potasu, siarki i cynku w glebie polowej były wyższe niż w eksperymencie doniczkowym, zaraza ryżu nadal rozprzestrzeniała się poprzez liście ryżu. Składniki odżywcze w glebie mogą nie być zbyt skuteczne w zwalczaniu zarazy ryżu, ponieważ wilgotność względna i temperatura nie sprzyjają silnemu zakażeniu patogenami.
W badaniach terenowych wykryto Stenotrophomonas maltophilia, P. dispersa, Xanthomonas sacchari, Burkholderia multivorans, Burkholderia diffusa, Burkholderia vietnamiensis i C. gleum we wszystkich rodzajach upraw. Stenotrophomonas maltophilia została wyizolowana z ryzosfery pszenicy, owsa, ogórka, kukurydzy i ziemniaka i wykazała skuteczność w biokontroli.działalnośćprzeciwko Colletotrichum nymphaeae.28 Ponadto doniesiono, że P. dispersa jest skuteczny przeciwko czarnejzgniliznasłodki ziemniak.29 Ponadto szczep R1 Xanthomonas sacchari wykazał antagonistyczne działanie przeciwko zarazie ryżu i zgniliźnie wiech wywoływanej przez Burkholderiaglumae.30Burkholderia oryzae NP19 może nawiązać symbiotyczną relację z tkanką ryżu podczas kiełkowania i stać się endemicznym grzybem symbiotycznym dla niektórych odmian ryżu. Podczas gdy inne bakterie glebowe mogą kolonizować ryż po przesadzeniu, grzyb wywołujący zarazę ryżową NP19, po skolonizowaniu, wpływa na wiele czynników w mechanizmie obronnym ryżu przed tą chorobą. NP19 nie tylko hamuje wzrost P. oryzae o ponad 50% (patrz tabela uzupełniająca S1 w dodatku online), ale także zmniejsza liczbę zmian chorobowych na liściach i zwiększa plony ryżu zaszczepionego lub skolonizowanego NP19 (RBf, RFf-B i RBFf-B) w próbach polowych (rysunek S3).
Grzyb Pyricularia oryzae, który powoduje zarazę roślin, jest grzybem hemitroficznym, który podczas infekcji wymaga składników odżywczych z rośliny żywicielskiej. Rośliny wytwarzają reaktywne formy tlenu (RFT), aby zahamować infekcję grzybiczą; jednak Pyricularia oryzae stosuje różne strategie, aby przeciwdziałać RFT produkowanym przez żywiciela.31Peroksydazy wydają się odgrywać rolę w oporności na patogeny, w tym w sieciowaniu białek ścian komórkowych, zagęszczaniu ścian ksylemu, produkcji ROS i neutralizacji nadtlenku wodoru.32Enzymy antyoksydacyjne mogą pełnić funkcję specyficznego systemu wychwytywania ROS. Dzięki swoim właściwościom antyoksydacyjnym dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) i peroksydaza (POD) wspomagają inicjację reakcji obronnych, przy czym SOD stanowi pierwszą linię obrony.33W ryżu aktywność peroksydazy roślinnej indukowana jest po zakażeniu patogenami roślinnymi, takimi jak *Pyricularia oryzae* i *Xanthomonas oryzae pv. Oryzae*.32W tym badaniu aktywność peroksydazy wzrosła w ryżu skolonizowanym i/lub zaszczepionym *Magnaporthe oryzae* NP19; jednakże *Magnaporthe oryzae* nie wpłynął na aktywność peroksydazy. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), jako syntaza H₂O₂, katalizuje redukcję O₂⁻ do H₂O₂. SOD odgrywa kluczową rolę w odporności roślin na różne stresy poprzez równoważenie stężenia H₂O₂ wewnątrz rośliny, zwiększając w ten sposób tolerancję roślin na różne stresy³⁴. W tym badaniu, w eksperymencie w doniczkach, 30 dni po zaszczepieniu *Magnaporthe oryzae* (30 DAT), aktywności SOD w grupach RF i RBF były odpowiednio o 121,9% i 104,5% wyższe niż w grupie R, co wskazuje na odpowiedź SOD na infekcję *Magnaporthe oryzae*. Zarówno w eksperymentach w doniczkach, jak i w polu, aktywność SOD w ryżu zaszczepionym *Magnaporthe oryzae* NP19 była odpowiednio o 67,7% i 28,8% wyższa niż w ryżu niezaszczepionym, po 30 dniach od zaszczepienia. Reakcje biochemiczne roślin zależą od środowiska, źródła stresu i rodzaju rośliny³⁵. Aktywność enzymów antyoksydacyjnych roślin jest bezpośrednio zależna od czynników środowiskowych, które z kolei wpływają na aktywność enzymów antyoksydacyjnych roślin poprzez modyfikację mikrobiomu roślinnego.
W badaniu tym wykorzystano grzyb wywołujący chorobę ryżu (Kosakonia oryziphila NP19, numer rejestracyjny NCBI PP861312)13wyizolowano z korzeni odmiany ryżu RD6 w prowincji Nakhon Phanom w Tajlandii (16° 59′ 42,9″ N 104° 22′ 17,9″ E). Szczep ten hodowano w bulionie odżywczym (NB) w temperaturze 30°C i przy 150 obr./min przez 18 godzin. Aby obliczyć stężenie bakterii, zmierzono absorbancję zawiesiny bakteryjnej przy 600 nm. Stężenie zawiesiny bakteryjnej dostosowano do10⁶CFU/ml przy użyciu sterylnej wody dejonizowanej (dH₂O). Grzyb wywołujący zarazę ryżową (Pyricularia oryzae) został punktowo zaszczepiony na agarze ziemniaczanym z dekstrozą (PDA) i inkubowany w temperaturze 25°C przez 7 dni. Grzybnię przeniesiono na podłoże agarowe z otrębami ryżowymi (2% (w/v) otrębów ryżowych, 0,5% (w/v) sacharozy i 2% (w/v) agaru rozpuszczonego w wodzie dejonizowanej, pH 7) i inkubowano w temperaturze 25°C przez 7 dni. Sterylizowany liść podatnej odmiany ryżu (KDML105) umieszczono na grzybni w celu wywołania zarodników i inkubowano w temperaturze 25°C przez 5 dni w skojarzonym świetle UV i białym. Zarodniki zebrano przez delikatne przetarcie grzybni i zainfekowanej powierzchni liścia 10 ml sterylizowanego 0,025% (v/v) roztworu Tween 20. Roztwór grzybów przefiltrowano przez osiem warstw gazy w celu usunięcia grzybni, agaru i liści ryżu. Stężenie zarodników konidialnych w zawiesinie dostosowano do 5 × 10⁵ zarodników/ml w celu dalszej analizy.
Świeże kultury komórek Kosakonia oryziphila NP19 przygotowano, hodując je w podłożu NB w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Po wirowaniu (3047 × g, 10 min) zebrano osad komórek, przemyto dwukrotnie 10 mM buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS, pH 7,2) i zawieszono w tym samym buforze. Gęstość optyczną zawiesiny komórek zmierzono przy długości fali 600 nm, uzyskując wartość około 1,0 (co odpowiada 1,0 × 10⁷ CFU/μl, określonej poprzez wysianie na płytki z agarem odżywczym). Konidia P. oryzae uzyskano, zawieszając je w roztworze PBS i licząc za pomocą hemocytometru. Zawiesiny *K. oryziphila* NP19 i *P. Do eksperymentów z rozmazem liści, zarodniki konidialne K. oryziphila* przygotowano na świeżych liściach ryżu w stężeniach odpowiednio 1,0 × 10⁷ CFU/μL i 5,0 × 10² zarodników/μL. Metoda przygotowania próbki ryżu była następująca: 5 cm długości liście z sadzonek ryżu odcięto i umieszczono w szalkach Petriego wyłożonych wilgotnym papierem chłonnym. Utworzono pięć grup doświadczalnych: (i) R: liście ryżu bez inokulacji bakteryjnej jako kontrola, uzupełnione 0,025% (v/v) roztworem Tween 20; (ii) RB + F: ryż zaszczepiony szczepem K. oryziphila NP19, uzupełnionym 2 μL zawiesiny zarodników grzyba powodującego zarazę ryżu; (iii) R + BF: Ryż w grupie R uzupełniono 4 μl mieszaniny zawiesiny zarodników grzyba i K. oryziphila NP19 (stosunek objętości 1:1); (iv) R + F: Ryż w grupie R uzupełniono 2 μl zawiesiny zarodników grzyba; (v) RF + B: Ryż w grupie R uzupełniono 2 μl zawiesiny zarodników grzyba inkubowano przez 30 h, a następnie dodano 2 μl K. oryziphila NP19 w tym samym miejscu. Wszystkie płytki Petriego inkubowano w temperaturze 25°C w ciemności przez 30 h, a następnie umieszczono w świetle ciągłym. Każdą grupę utworzono trzykrotnie. Po 72 h hodowli tkanki roślinne obserwowano i analizowano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). W skrócie, tkanki roślinne utrwalono w buforze fosforanowym zawierającym 2,5% (v/v) glutaraldehydu i odwodniono za pomocą serii roztworów etanolu. Po wysuszeniu w punkcie krytycznym dwutlenkiem węgla, próbki pokryto napylaniem jonowym złota i ostatecznie zbadano pod mikroskopem skaningowym.15
Czas publikacji: 15 grudnia 2025 r.