Lek przeciwrobaczy N,N-dietylo-m-toluamid (DEET) hamuje AChE (acetylocholinoesterazę) i ma potencjalne właściwości rakotwórcze ze względu na nadmierne unaczynienie. W tym artykule wykazujemy, że DEET specyficznie stymuluje komórki śródbłonka, które promują angiogenezę, zwiększając w ten sposób wzrost guza. DEET aktywuje procesy komórkowe prowadzące do angiogenezy, w tym proliferację, migrację i adhezję. Jest to związane ze zwiększoną produkcją NO i ekspresją VEGF w komórkach śródbłonka. Wyciszenie M3 lub zastosowanie farmakologicznych inhibitorów M3 zniosło wszystkie te efekty, co sugeruje, że angiogeneza indukowana przez DEET jest wrażliwa na M3. Eksperymenty dotyczące sygnalizacji wapniowej w komórkach śródbłonka i HEK z nadekspresją receptorów M3, a także badania wiązania i dokowania wskazują, że DEET działa jako allosteryczny modulator receptorów M3. Ponadto DEET hamuje AChE, zwiększając w ten sposób biodostępność acetylocholiny i jej wiązanie z receptorami M3 oraz wzmacniając działanie proangiogenne poprzez regulację allosteryczną.
Pierwotne komórki EC wyizolowano z aorty myszy szwajcarskich. Metodę ekstrakcji zaadaptowano z protokołu Kobayashiego26. Mysie komórki EC hodowano w podłożu EBM-2 uzupełnionym 5% inaktywowanym termicznie FBS do czwartego pasażu.
Wpływ dwóch stężeń DEET na proliferację komórek HUVEC, U87MG lub BF16F10 analizowano za pomocą zestawu CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). W skrócie, 5,103 komórek na dołek wysiano na płytkę 96-dołkową, pozostawiono na noc do przywarcia, a następnie poddano działaniu DEET przez 24 godziny. Po usunięciu pożywki, do każdego dołka mikropłytki dodano roztwór wiążący barwnik i inkubowano komórki w temperaturze 37°C przez 30 minut. Poziom fluorescencji określono za pomocą wielomodowego czytnika mikropłytek Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Niemcy) wyposażonego w filtry wzbudzające o długości fali 485 nm i filtry emisyjne o długości fali 530 nm.
Komórki HUVEC wysiano na płytki 96-dołkowe w gęstości 104 komórek na dołek. Komórki traktowano DEET przez 24 godziny. Żywotność komórek oceniano za pomocą kolorymetrycznego testu MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Wartości gęstości optycznej uzyskano na wielomodowym czytniku mikropłytek (Mithras LB940) przy długości fali 570 nm.
Działanie DEET badano za pomocą testów angiogenezy in vitro. Leczenie DEET w stężeniu 10-8 M lub 10-5 M zwiększyło długość naczyń włosowatych w komórkach HUVEC (ryc. 1a, b, białe słupki). W porównaniu z grupą kontrolną, leczenie DEET w stężeniach od 10-14 do 10-5 M wykazało, że długość naczyń włosowatych osiągnęła plateau przy stężeniu DEET 10-8 M (Ryc. uzupełniająca S2). Nie stwierdzono istotnych różnic w proangiogennym działaniu in vitro komórek HUVEC leczonych DEET w zakresie stężeń 10-8 M i 10-5 M.
Aby określić wpływ DEET na neowaskularyzację, przeprowadziliśmy badania in vivo. Po 14 dniach u myszy, którym wstrzyknięto komórki śródbłonka wstępnie hodowane z DEET w stężeniu 10-8 M lub 10-5 M, zaobserwowano istotny wzrost zawartości hemoglobiny (ryc. 1c, białe słupki).
Ponadto, badano neowaskularyzację indukowaną przez DEET u myszy z ksenoprzeszczepem U87MG, którym wstrzykiwano codziennie (ip) DEET w dawce, o której wiadomo, że indukuje stężenie w osoczu wynoszące 10-5 M, co jest prawidłowe u narażonych ludzi. w 23. Wykrywalne guzy (tj. guzy >100 mm3) obserwowano 14 dni po wstrzyknięciu komórek U87MG myszom. W 28. dniu wzrost guza był istotnie zwiększony u myszy leczonych DEET w porównaniu z myszami kontrolnymi (ryc. 1d, kwadraty). Ponadto, barwienie guzów CD31 wykazało, że DEET istotnie zwiększył powierzchnię naczyń włosowatych, ale nie gęstość naczyń mikronaczyniowych. (ryc. 1e–g).
Aby określić rolę receptorów muskarynowych w proliferacji indukowanej przez DETA, zastosowano DETA w stężeniu 10-8 M lub 10-5 M w obecności pFHHSiD (10-7 M, selektywnego antagonisty receptora M3). Leczenie komórek HUVEC. pFHHSiD całkowicie zablokował proliferacyjne właściwości DETA we wszystkich stężeniach (Tabela 1).
W tych warunkach zbadaliśmy również, czy DEET zwiększy długość naczyń włosowatych w komórkach HUVEC. Podobnie, pFHHSiD znacząco zapobiegał wzrostowi długości naczyń włosowatych indukowanemu przez DEET (ryc. 1a, b, szare słupki). Ponadto, podobne eksperymenty przeprowadzono z siRNA M3. Chociaż siRNA kontrolne nie było skuteczne w promowaniu tworzenia naczyń włosowatych, wyciszenie receptora muskarynowego M3 zniweczyło zdolność DEET do zwiększania długości naczyń włosowatych (ryc. 1a, b, czarne słupki).
Co więcej, zarówno unaczynienie indukowane przez DEET w stężeniu 10-8 M, jak i 10-5 M in vitro, jak i neowaskularyzacja in vivo zostały całkowicie zablokowane przez pFHHSiD (ryc. 1c, d, kółka). Wyniki te wskazują, że DEET promuje angiogenezę poprzez szlak wrażliwy na selektywne antagonisty receptora M3 lub siRNA M3.
AChE jest celem molekularnym DEET. Leki takie jak donepezil, które działają jako inhibitory AChE, mogą stymulować angiogenezę komórek śródbłonka naczyń in vitro oraz w mysich modelach niedokrwienia kończyn tylnych14. Przetestowaliśmy wpływ dwóch stężeń DEET na aktywność enzymu AChE w komórkach HUVEC. Niskie (10-8 M) i wysokie (10-5 M) stężenia DEET zmniejszały aktywność AChE w śródbłonku w porównaniu z warunkami kontrolnymi (ryc. 2).
Oba stężenia DEET (10-8 M i 10-5 M) zmniejszyły aktywność acetylocholinoesterazy w komórkach HUVEC. BW284c51 (10-5 M) zastosowano jako kontrolę dla inhibitorów acetylocholinoesterazy. Wyniki przedstawiono jako procent aktywności AChE w komórkach HUVEC leczonych dwoma stężeniami DEET w porównaniu z komórkami traktowanymi nośnikiem. Wartości przedstawiono jako średnią ± SEM z sześciu niezależnych eksperymentów. *p < 0,05 w porównaniu z kontrolą (test wielokrotnych porównań Kruskala-Wallisa i Dunna).
Tlenek azotu (NO) bierze udział w procesie angiogennym 33, dlatego też badano produkcję NO w komórkach HUVEC stymulowanych DEET. Produkcja NO w śródbłonku leczonym DEET była zwiększona w porównaniu z komórkami kontrolnymi, ale osiągnęła istotność statystyczną dopiero przy dawce 10-8 M (ryc. 3c). Aby określić zmiany molekularne kontrolujące produkcję NO indukowaną DEET, ekspresję i aktywację eNOS analizowano metodą Western blotting. Chociaż leczenie DEET nie zmieniło ekspresji eNOS, istotnie zwiększyło fosforylację eNOS w miejscu aktywacji (Ser-1177), jednocześnie zmniejszając jej miejsce hamowania (Thr-495) w porównaniu z komórkami nieleczonymi w fosforylację eNOS (ryc. 3d). Ponadto, stosunek fosforylowanej eNOS w miejscu aktywacji i miejscu hamowania obliczono po normalizacji ilości fosforylowanej eNOS do całkowitej ilości enzymu. W komórkach HUVEC leczonych każdym stężeniem DEET stosunek ten był znacząco wyższy w porównaniu do komórek nieleczonych (ryc. 3d).
Na koniec, ekspresję VEGF, jednego z głównych czynników proangiogennych, przeanalizowano metodą Western blot. DEET znacząco zwiększył ekspresję VEGF, natomiast pFHHSiD całkowicie ją zablokował.
Ponieważ działanie DEET jest wrażliwe zarówno na blokadę farmakologiczną, jak i na regulację w dół receptorów M3, przetestowaliśmy hipotezę, że DEET może wzmacniać sygnalizację wapniową. Co zaskakujące, DEET nie zwiększył stężenia wapnia w cytoplazmie komórek HUVEC (dane nieprzedstawione) ani HEK/M3 (ryc. 4a, b) w przypadku obu zastosowanych stężeń.
Czas publikacji: 30 grudnia 2024 r.