Lek przeciwrobaczy N,N-dietylo-m-toluamid (DEET) hamuje AChE (acetylocholinoesterazę) i ma potencjalne właściwości rakotwórcze ze względu na nadmierną waskularyzację. W tym artykule pokazujemy, że DEET specyficznie stymuluje komórki śródbłonka, które promują angiogenezę, zwiększając tym samym wzrost guza. DEET aktywuje procesy komórkowe prowadzące do angiogenezy, w tym proliferację, migrację i adhezję. Jest to związane ze zwiększoną produkcją NO i ekspresją VEGF w komórkach śródbłonka. Wyciszenie M3 lub stosowanie farmakologicznych inhibitorów M3 zniosło wszystkie te efekty, co sugeruje, że angiogeneza indukowana przez DEET jest wrażliwa na M3. Eksperymenty obejmujące sygnalizację wapniową w komórkach śródbłonka i HEK nadmiernie eksprymujących receptory M3, a także badania wiązania i dokowania wskazują, że DEET działa jako allosteryczny modulator receptorów M3. Ponadto DEET hamuje AChE, zwiększając tym samym biodostępność acetylocholiny i jej wiązanie z receptorami M3 oraz wzmacniając proangiogenne efekty poprzez regulację allosteryczną.
Pierwotne EC wyizolowano z aorty myszy szwajcarskich. Metodę ekstrakcji zaadaptowano z protokołu Kobayashi 26 . Mysie EC hodowano w podłożu EBM-2 uzupełnionym o 5% inaktywowanego cieplnie FBS do czwartego pasażu.
Wpływ dwóch stężeń DEET na proliferację HUVEC, U87MG lub BF16F10 analizowano przy użyciu zestawu CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). W skrócie, 5,103 komórek na dołek wysiano na płytkę 96-dołkową, pozostawiono na noc do przytwierdzenia, a następnie poddano działaniu DEET przez 24 godziny. Po usunięciu podłoża wzrostowego, do każdego dołka mikropłytki dodano roztwór wiążący barwnik i inkubowano komórki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Poziomy fluorescencji określono przy użyciu wielomodowego czytnika mikropłytek Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Niemcy) wyposażonego w filtry wzbudzające 485 nm i filtry emisyjne 530 nm.
Komórki HUVEC posiano na 96-dołkowe płytki w gęstości 104 komórek na dołek. Komórki traktowano DEET przez 24 godziny. Żywotność komórek oceniano za pomocą kolorymetrycznego testu MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Wartości gęstości optycznej uzyskano na wielomodowym czytniku mikropłytek (Mithras LB940) przy długości fali 570 nm.
Efekty DEET badano przy użyciu testów angiogenezy in vitro. Leczenie 10-8 M lub 10-5 M DEET zwiększyło tworzenie długości naczyń włosowatych w HUVEC (Rys. 1a, b, białe słupki). W porównaniu z grupą kontrolną, leczenie stężeniami DEET w zakresie od 10-14 do 10-5 M wykazało, że długość naczyń włosowatych osiągnęła plateau przy 10-8 M DEET (Rys. uzupełniający S2). Nie stwierdzono istotnej różnicy w proangiogennym działaniu in vitro HUVEC leczonych DEET w zakresie stężeń 10-8 M i 10-5 M.
Aby określić wpływ DEET na neowaskularyzację, przeprowadziliśmy badania neowaskularyzacji in vivo. Po 14 dniach myszy wstrzyknięte komórkami śródbłonka wstępnie hodowanymi z 10-8 M lub 10-5 M DEET wykazały znaczący wzrost zawartości hemoglobiny (ryc. 1c, białe słupki).
Ponadto badano neowaskularyzację wywołaną przez DEET u myszy z ksenograftem U87MG, którym wstrzykiwano codziennie (ip) DEET w dawce, o której wiadomo, że indukuje stężenia w osoczu wynoszące 10-5 M, co jest normalne u narażonych ludzi. w 23. Wykrywalne guzy (tj. guzy >100 mm3) obserwowano 14 dni po wstrzyknięciu komórek U87MG myszom. W dniu 28 wzrost guza był istotnie zwiększony u myszy leczonych DEET w porównaniu z myszami kontrolnymi (ryc. 1d, kwadraty). Ponadto barwienie guzów CD31 wykazało, że DEET istotnie zwiększył powierzchnię naczyń włosowatych, ale nie gęstość mikronaczyń. (ryc. 1e–g).
Aby określić rolę receptorów muskarynowych w proliferacji indukowanej przez DETA, użyto 10-8 M lub 10-5 M DETA w obecności pFHHSiD (10-7 M, selektywny antagonista receptora M3). Leczenie HUVEC. pFHHSiD całkowicie zablokował właściwości proliferacyjne DETA we wszystkich stężeniach (Tabela 1).
W tych warunkach sprawdziliśmy również, czy DEET zwiększy długość naczyń włosowatych w komórkach HUVEC. Podobnie, pFHHSiD znacząco zapobiegło indukowanej przez DEET długości naczyń włosowatych (Rys. 1a, b, szare słupki). Ponadto, podobne eksperymenty przeprowadzono z siRNA M3. Chociaż siRNA kontrolne nie było skuteczne w promowaniu tworzenia naczyń włosowatych, wyciszenie receptora muskarynowego M3 zniosło zdolność DEET do zwiększania długości naczyń włosowatych (Rys. 1a, b, czarne słupki).
Co więcej, zarówno 10-8 M, jak i 10-5 M DEET in vitro indukowane waskularyzacją, jak i neowaskularyzacja in vivo zostały całkowicie zablokowane przez pFHHSiD (Ryc. 1c, d, kółka). Wyniki te wskazują, że DEET promuje angiogenezę poprzez ścieżkę wrażliwą na selektywnych antagonistów receptora M3 lub siRNA M3.
AChE jest molekularnym celem DEET. Leki takie jak donepezil, które działają jako inhibitory AChE, mogą stymulować angiogenezę EC in vitro i w mysich modelach niedokrwienia kończyn tylnych14. Przetestowaliśmy wpływ dwóch stężeń DEET na aktywność enzymu AChE w HUVEC. Niskie (10-8 M) i wysokie (10-5 M) stężenia DEET zmniejszały aktywność śródbłonkowego AChE w porównaniu z warunkami kontrolnymi (ryc. 2).
Oba stężenia DEET (10-8 M i 10-5 M) zmniejszyły aktywność acetylocholinoesterazy w komórkach HUVEC. BW284c51 (10-5 M) zastosowano jako kontrolę dla inhibitorów acetylocholinoesterazy. Wyniki wyrażono jako procent aktywności AChE w komórkach HUVEC leczonych dwoma stężeniami DEET w porównaniu do komórek leczonych nośnikiem. Wartości wyrażono jako średnia ± SEM z sześciu niezależnych eksperymentów. *p < 0,05 w porównaniu do kontroli (test wielokrotnych porównań Kruskala-Wallisa i Dunna).
Tlenek azotu (NO) bierze udział w procesie angiogenicznym 33, dlatego też badano produkcję NO w komórkach HUVEC stymulowanych DEET. Produkcja NO w śródbłonku leczona DEET była zwiększona w porównaniu z komórkami kontrolnymi, ale osiągnęła istotność statystyczną dopiero przy dawce 10-8 M (ryc. 3c). Aby określić zmiany molekularne kontrolujące produkcję NO indukowaną przez DEET, ekspresję i aktywację eNOS analizowano metodą Western blotting. Chociaż leczenie DEET nie zmieniło ekspresji eNOS, znacząco zwiększyło fosforylację eNOS w miejscu aktywacji (Ser-1177), jednocześnie zmniejszając miejsce hamowania (Thr-495) w porównaniu z komórkami nieleczonymi w fosforylacji eNOS (ryc. 3d). Ponadto stosunek fosforylowanego eNOS w miejscu aktywacji i miejscu hamowania obliczono po znormalizowaniu ilości fosforylowanego eNOS do całkowitej ilości enzymu. W komórkach HUVEC leczonych każdym stężeniem DEET stosunek ten był istotnie wyższy w porównaniu do komórek nieleczonych (ryc. 3d).
Na koniec, ekspresję VEGF, jednego z głównych czynników proangiogennych, analizowano metodą Western blotting. DEET znacząco zwiększył ekspresję VEGF, podczas gdy pFHHSiD całkowicie zablokował tę ekspresję.
Ponieważ efekty DEET są wrażliwe zarówno na blokadę farmakologiczną, jak i regulację w dół receptorów M3, przetestowaliśmy hipotezę, że DEET może wzmacniać sygnalizację wapniową. Co zaskakujące, DEET nie zwiększyło stężenia wapnia cytoplazmatycznego w HUVEC (dane nieprzedstawione) i HEK/M3 (ryc. 4a, b) dla obu użytych stężeń.
Czas publikacji: 30-12-2024