W niniejszym badaniu oceniano stymulujące efekty skojarzonego leczeniaregulatory wzrostu roślinZbadano wpływ nanocząstek tlenku żelaza (2,4-D i kinetyny) oraz nanocząstek tlenku żelaza (Fe₃O₄-NPs) na morfogenezę in vitro i produkcję metabolitów wtórnych w *Hypericum perforatum* L. Zoptymalizowane leczenie [2,4-D (0,5 mg/l) + kinetyna (2 mg/l) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/l)] znacząco poprawiło parametry wzrostu roślin: wysokość roślin wzrosła o 59,6%, długość korzeni o 114,0%, liczba pąków o 180,0%, a świeża masa kalusa o 198,3% w porównaniu z grupą kontrolną. To łączone leczenie poprawiło również wydajność regeneracji (50,85%) i zwiększyło zawartość hiperycyny o 66,6%. Analiza GC-MS wykazała wysoką zawartość hiperozydu, β-patolenu i alkoholu cetylowego, stanowiących 93,36% całkowitej powierzchni piku, podczas gdy całkowita zawartość związków fenolowych i flawonoidów wzrosła aż o 80,1%. Wyniki te wskazują, że regulatory wzrostu roślin (PGR) i nanocząsteczki Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) wywierają efekt synergistyczny, stymulując organogenezę i akumulację związków bioaktywnych, co stanowi obiecującą strategię biotechnologicznego doskonalenia roślin leczniczych.
Dziurawiec zwyczajny (Hypericum perforatum L.), znany również jako ziele dziurawca, jest wieloletnią rośliną zielną z rodziny dziurawcowatych o wartości gospodarczej[1]. Do jej potencjalnych składników bioaktywnych należą naturalne garbniki, ksantony, floroglucynol, naftalenodiantron (hiperyna i pseudohiperyna), flawonoidy, kwasy fenolowe i olejki eteryczne[2,3,4]. Dziurawiec zwyczajny można rozmnażać tradycyjnymi metodami, jednak sezonowość tradycyjnych metod, niska zdolność kiełkowania nasion i podatność na choroby ograniczają jego potencjał do uprawy na dużą skalę i ciągłego wytwarzania metabolitów wtórnych[1,5,6].
W związku z tym hodowla tkankowa in vitro jest uważana za skuteczną metodę szybkiego rozmnażania roślin, ochrony zasobów plazmy zarodkowej i zwiększenia wydajności związków leczniczych [7, 8]. Regulatory wzrostu roślin (PGR) odgrywają kluczową rolę w regulacji morfogenezy i są niezbędne do hodowli in vitro kalusa i całych organizmów. Optymalizacja ich stężeń i kombinacji jest kluczowa dla pomyślnego zakończenia tych procesów rozwojowych [9]. Dlatego zrozumienie odpowiedniego składu i stężenia regulatorów jest istotne dla poprawy wzrostu i zdolności regeneracyjnych dziurawca zwyczajnego (H. perforatum) [10].
Nanocząstki tlenku żelaza (Fe₃O₄) to klasa nanocząstek, które były lub są opracowywane do hodowli tkankowych. Fe₃O₄ charakteryzuje się znaczącymi właściwościami magnetycznymi, dobrą biozgodnością oraz zdolnością do wspomagania wzrostu roślin i redukcji stresu środowiskowego, dlatego też przyciągnął znaczną uwagę w projektach hodowli tkankowych. Potencjalne zastosowania tych nanocząstek mogą obejmować optymalizację hodowli in vitro w celu stymulacji podziału komórek, poprawy wchłaniania składników odżywczych i aktywacji enzymów antyoksydacyjnych [11].
Chociaż nanocząstki wykazały dobry wpływ na wzrost roślin, badania nad łączonym zastosowaniem nanocząstek Fe₃O₄ i zoptymalizowanych regulatorów wzrostu roślin u *H. perforatum* pozostają skąpe. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, niniejsze badanie oceniło wpływ ich łącznego działania na morfogenezę in vitro i produkcję metabolitów wtórnych, dostarczając nowych spostrzeżeń na temat poprawy właściwości roślin leczniczych. W związku z tym niniejsze badanie ma dwa cele: (1) optymalizację stężenia regulatorów wzrostu roślin w celu skutecznego stymulowania tworzenia kalusa, regeneracji pędów i ukorzeniania in vitro; oraz (2) ocenę wpływu nanocząstek Fe₃O₄ na parametry wzrostu in vitro. Plany na przyszłość obejmują ocenę wskaźnika przeżywalności zregenerowanych roślin podczas aklimatyzacji (in vitro). Oczekuje się, że wyniki niniejszego badania znacząco poprawią wydajność mikrorozmnażania *H. perforatum*, przyczyniając się tym samym do zrównoważonego wykorzystania i biotechnologicznych zastosowań tej ważnej rośliny leczniczej.
W niniejszym badaniu uzyskaliśmy eksplantaty liści z polowych, jednorocznych roślin dziurawca zwyczajnego (roślin matecznych). Eksplantaty te wykorzystano do optymalizacji warunków hodowli in vitro. Przed hodowlą liście dokładnie opłukano pod bieżącą wodą destylowaną przez kilka minut. Powierzchnie eksplantatów zdezynfekowano poprzez zanurzenie w 70% etanolu na 30 sekund, a następnie w 1,5% roztworze podchlorynu sodu (NaOCl) z dodatkiem kilku kropli Tween 20 na 10 minut. Na koniec eksplantaty przepłukano trzykrotnie sterylną wodą destylowaną przed przeniesieniem na kolejną pożywkę hodowlaną.
Przez kolejne cztery tygodnie mierzono parametry regeneracji pędów, w tym tempo regeneracji, liczbę pędów na eksplantat oraz długość pędu. Gdy zregenerowane pędy osiągnęły długość co najmniej 2 cm, przenoszono je na podłoże ukorzeniające składające się z pożywki MS o połowie stężenia, kwasu indolobutyrowego (IBA) o stężeniu 0,5 mg/l i 0,3% gumy guar. Hodowlę ukorzeniającą prowadzono przez trzy tygodnie, mierząc tempo ukorzeniania, liczbę i długość korzeni. Każde badanie powtórzono trzykrotnie, hodując 10 eksplantatów na powtórzenie, co dało około 30 eksplantatów na badanie.
Wysokość roślin mierzono w centymetrach (cm) za pomocą linijki, od podstawy rośliny do czubka najwyższego liścia. Długość korzeni mierzono w milimetrach (mm) bezpośrednio po ostrożnym usunięciu sadzonek i usunięciu podłoża uprawowego. Liczbę pąków na eksplantat liczono bezpośrednio na każdej roślinie. Liczbę czarnych plam na liściach, zwanych brodawkami, mierzono wizualnie. Uważa się, że te czarne brodawki są gruczołami zawierającymi hiperycynę lub plamy oksydacyjne i są wykorzystywane jako fizjologiczny wskaźnik reakcji rośliny na zabieg. Po usunięciu całego podłoża uprawowego mierzono świeżą masę sadzonek za pomocą wagi elektronicznej z dokładnością do miligramów (mg).
Metoda obliczania tempa tworzenia kalusa jest następująca: po hodowli eksplantatów w pożywce zawierającej różne regulatory wzrostu (kinazy, 2,4-D i Fe3O4) przez cztery tygodnie, zlicza się liczbę eksplantatów zdolnych do utworzenia kalusa. Wzór na obliczanie tempa tworzenia kalusa jest następujący:
Każdy zabieg powtórzono trzykrotnie, badając za każdym razem co najmniej 10 eksplantatów.
Tempo regeneracji odzwierciedla odsetek tkanki kalusa, która pomyślnie przechodzi proces różnicowania pąków po etapie formowania kalusa. Wskaźnik ten pokazuje zdolność tkanki kalusa do przekształcania się w tkankę zróżnicowaną i wzrostu w nowe organy rośliny.
Współczynnik ukorzenienia to stosunek liczby gałęzi zdolnych do ukorzenienia się do całkowitej liczby gałęzi. Wskaźnik ten odzwierciedla sukces fazy ukorzeniania, która jest kluczowa w mikrorozmnażaniu i rozmnażaniu roślin, ponieważ dobre ukorzenienie pomaga siewkom lepiej przetrwać w warunkach wzrostu.
Związki hiperycyny ekstrahowano 90% metanolem. Pięćdziesiąt mg wysuszonego materiału roślinnego dodano do 1 ml metanolu i poddano działaniu ultradźwięków przez 20 minut z częstotliwością 30 kHz w myjce ultradźwiękowej (model A5120-3YJ) w temperaturze pokojowej, w ciemności. Po sonikacji próbkę wirowano z prędkością 6000 obr./min przez 15 minut. Zebrano supernatant i zmierzono absorbancję hiperycyny przy długości fali 592 nm za pomocą spektrofotometru Plus-3000 S zgodnie z metodą opisaną przez Conceiçao i in. [14].
Większość zabiegów z regulatorami wzrostu roślin (PGR) i nanocząstkami tlenku żelaza (Fe₃O₄-NP) nie powodowała powstawania czarnych brodawek na zregenerowanych liściach pędów. Nie zaobserwowano brodawek w żadnym z zabiegów z 0,5 lub 1 mg/l 2,4-D, 0,5 lub 1 mg/l kinetyny ani 1, 2 lub 4 mg/l nanocząstek tlenku żelaza. Kilka kombinacji wykazało niewielki wzrost rozwoju brodawek (ale nieistotny statystycznie) przy wyższych stężeniach kinetyny i/lub nanocząstek tlenku żelaza, takich jak połączenie 2,4-D (0,5–2 mg/l) z kinetyną (1–1,5 mg/l) i nanocząstkami tlenku żelaza (2–4 mg/l). Wyniki te przedstawiono na rysunku 2. Czarne brodawki reprezentują gruczoły bogate w hiperycynę, zarówno występujące naturalnie, jak i pożyteczne. W tym badaniu czarne guzki były głównie związane z brązowieniem tkanek, co wskazuje na sprzyjające środowisko do akumulacji hiperycyny. Leczenie nanocząstkami 2,4-D, kinetyną i Fe₃O₄ promowało wzrost kalusa, zmniejszało brązowienie i zwiększało zawartość chlorofilu, co sugeruje poprawę funkcji metabolicznych i potencjalną redukcję uszkodzeń oksydacyjnych [37]. W tym badaniu oceniono wpływ kinetyny w połączeniu z nanocząstkami 2,4-D i Fe₃O₄ na wzrost i rozwój kalusa dziurawca (rys. 3a–g). Poprzednie badania wykazały, że nanocząstki Fe₃O₄ mają działanie przeciwgrzybicze i przeciwdrobnoustrojowe [38, 39], a w połączeniu z regulatorami wzrostu roślin mogą stymulować mechanizmy obronne roślin i zmniejszać wskaźniki stresu komórkowego [18]. Chociaż biosynteza metabolitów wtórnych jest regulowana genetycznie, ich rzeczywista wydajność jest w dużym stopniu zależna od warunków środowiskowych. Zmiany metaboliczne i morfologiczne mogą wpływać na poziom metabolitów wtórnych poprzez regulację ekspresji specyficznych genów roślinnych i reakcję na czynniki środowiskowe. Co więcej, induktory mogą wyzwalać aktywację nowych genów, które z kolei stymulują aktywność enzymatyczną, ostatecznie aktywując wiele szlaków biosyntezy i prowadząc do powstawania metabolitów wtórnych. Co więcej, inne badanie wykazało, że zmniejszenie zacienienia zwiększa ekspozycję na światło słoneczne, a tym samym podnosi dzienne temperatury w naturalnym środowisku *Hypericum perforatum*, co również przyczynia się do wzrostu plonów hiperycyny. W oparciu o te dane, w niniejszym badaniu zbadano rolę nanocząsteczek żelaza jako potencjalnych induktorów w hodowlach tkankowych. Wyniki pokazały, że te nanocząsteczki mogą aktywować geny zaangażowane w biosyntezę hesperydyny poprzez stymulację enzymatyczną, co prowadzi do zwiększonej akumulacji tego związku (ryc. 2). Dlatego też, w porównaniu z roślinami rosnącymi w warunkach naturalnych, można argumentować, że produkcja takich związków in vivo może być również zwiększona, gdy umiarkowany stres jest połączony z aktywacją genów zaangażowanych w biosyntezę metabolitów wtórnych. Zabiegi łączone mają na ogół pozytywny wpływ na szybkość regeneracji, ale w niektórych przypadkach efekt ten jest osłabiony. Co godne uwagi, leczenie 1 mg/l 2,4-D, 1,5 mg/l kinazy i różnymi stężeniami mogło niezależnie i znacząco zwiększyć szybkość regeneracji o 50,85% w porównaniu z grupą kontrolną (rys. 4c). Wyniki te sugerują, że określone kombinacje nanohormonów mogą działać synergistycznie, aby promować wzrost roślin i produkcję metabolitów, co ma ogromne znaczenie dla hodowli tkankowej roślin leczniczych. Palmer i Keller [50] wykazali, że leczenie 2,4-D mogło niezależnie indukować tworzenie kalusa w St. perforatum, podczas gdy dodanie kinazy znacząco zwiększyło tworzenie kalusa i regenerację. Efekt ten wynikał z poprawy równowagi hormonalnej i stymulacji podziału komórek. Bal i in. [51] odkryli, że leczenie Fe₃O₄-NP mogło niezależnie wzmacniać funkcję enzymów antyoksydacyjnych, promując w ten sposób wzrost korzeni w St. perforatum. Podłoża hodowlane zawierające nanocząstki Fe₃O₄ w stężeniach 0,5 mg/l, 1 mg/l i 1,5 mg/l poprawiły tempo regeneracji roślin lnu [52]. Zastosowanie kinetyny, 2,4-dichlorobenzotiazolinonu i nanocząstek Fe₃O₄ znacząco poprawiło tempo tworzenia kalusa i korzeni, jednak należy wziąć pod uwagę potencjalne skutki uboczne stosowania tych hormonów do regeneracji in vitro. Na przykład długotrwałe lub wysokie stężenie 2,4-dichlorobenzotiazolinonu lub kinetyny może skutkować somatyczną zmiennością klonalną, stresem oksydacyjnym, nieprawidłową morfologią kalusa lub witryfikacja. Dlatego wysokie tempo regeneracji niekoniecznie przewiduje stabilność genetyczną. Wszystkie zregenerowane rośliny powinny zostać ocenione za pomocą markerów molekularnych (np. RAPD, ISSR, AFLP) lub analizy cytogenetycznej w celu określenia ich jednorodności i podobieństwa do roślin in vivo [53,54,55].
Niniejsze badanie po raz pierwszy wykazało, że łączne zastosowanie regulatorów wzrostu roślin (2,4-D i kinetyny) z nanocząsteczkami Fe₃O₄ może nasilać morfogenezę i akumulację kluczowych metabolitów bioaktywnych (w tym hiperycyny i hiperozydu) w *Hypericum perforatum*. Zoptymalizowany schemat leczenia (1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l kinetyny + 4 mg/l Fe₃O₄-NP) nie tylko zmaksymalizował tworzenie kalusa, organogenezę i wydajność metabolitów wtórnych, ale także wykazał łagodny efekt indukujący, potencjalnie poprawiając tolerancję rośliny na stres i wartość leczniczą. Połączenie nanotechnologii i hodowli tkanek roślinnych zapewnia zrównoważoną i wydajną platformę do produkcji związków leczniczych in vitro na dużą skalę. Wyniki te otwierają drogę do zastosowań przemysłowych i przyszłych badań nad mechanizmami molekularnymi, optymalizacją dawkowania i precyzją genetyczną, łącząc tym samym badania podstawowe nad roślinami leczniczymi z praktyczną biotechnologią.
Czas publikacji: 12 grudnia 2025 r.