Wzrost merystemu wierzchołkowego pędu (SAM) jest krytyczny dla architektury łodygi. Hormony roślinnegibereliny(GA) odgrywają kluczową rolę w koordynacji wzrostu roślin, ale ich rola w SAM pozostaje słabo poznana. W tym przypadku opracowaliśmy ratiometryczny biosensor sygnalizacji GA poprzez inżynierię białka DELLA w celu stłumienia jego zasadniczej funkcji regulacyjnej w odpowiedzi transkrypcyjnej GA, jednocześnie zachowując jego degradację po rozpoznaniu GA. Wykazaliśmy, że ten biosensor oparty na degradacji dokładnie rejestruje zmiany poziomów GA i wykrywania komórkowego podczas rozwoju. Użyliśmy tego biosensora do mapowania aktywności sygnalizacji GA w SAM. Wykazaliśmy, że wysokie sygnały GA występują głównie w komórkach zlokalizowanych między zawiązkami organów, które są prekursorami komórek międzywęźli. Korzystając z podejść zysku i utraty funkcji, wykazaliśmy ponadto, że GA reguluje orientację płaszczyzny podziału komórkowego, ustanawiając kanoniczną organizację komórkową międzywęźli, promując w ten sposób specyfikację międzywęźli w SAM.
Wierzchołkowy merystem pędu (SAM), zlokalizowany na szczycie pędu, zawiera niszę komórek macierzystych, których aktywność generuje organy boczne i węzły łodygi w sposób modułowy i iteracyjny przez całe życie rośliny. Każda z tych powtarzających się jednostek, czyli węzłów roślinnych, obejmuje międzywęźla i organy boczne w węzłach oraz merystemy pachowe w kątach liści1. Wzrost i organizacja węzłów roślinnych zmieniają się w trakcie rozwoju. U Arabidopsis wzrost międzywęźli jest tłumiony w fazie wegetatywnej, a merystemy pachowe pozostają uśpione w kątach liści rozetkowych. Podczas przejścia do fazy kwiatowej SAM staje się merystemem kwiatostanu, generując wydłużone międzywęźla i pąki pachowe, gałązki w kątach liści łodygowych, a później kwiaty bezlistne2. Chociaż poczyniliśmy znaczne postępy w zrozumieniu mechanizmów kontrolujących rozwój liści, kwiatów i gałęzi, stosunkowo niewiele wiemy o tym, w jaki sposób powstają międzywęźla.
Zrozumienie czasoprzestrzennego rozkładu GA pomoże lepiej zrozumieć funkcje tych hormonów w różnych tkankach i na różnych etapach rozwoju. Wizualizacja degradacji fuzji RGA-GFP wyrażonej pod wpływem własnego promotora dostarcza ważnych informacji na temat regulacji całkowitych poziomów GA w korzeniach15,16. Jednak ekspresja RGA różni się w różnych tkankach17 i jest regulowana przez GA18. Zatem różnicowa ekspresja promotora RGA może skutkować wzorem fluorescencji obserwowanym w przypadku RGA-GFP, a zatem ta metoda nie jest ilościowa. Niedawno bioaktywna znakowana fluoresceiną (Fl) GA19,20 ujawniła akumulację GA w endokorteksie korzenia i regulację jego poziomów komórkowych przez transport GA. Niedawno czujnik GA FRET nlsGPS1 wykazał, że poziomy GA korelują z wydłużaniem komórek w korzeniach, włóknach i ciemno rosnących hipokotylach21. Jednakże, jak widzieliśmy, stężenie GA nie jest jedynym parametrem kontrolującym aktywność sygnalizacyjną GA, ponieważ zależy od złożonych procesów wykrywania. Tutaj, opierając się na naszej wiedzy na temat szlaków sygnałowych DELLA i GA, przedstawiamy opracowanie i charakterystykę opartego na degradacji ratiometrycznego biosensora do sygnalizacji GA. Aby opracować ten ilościowy biosensor, użyliśmy zmutowanego RGA wrażliwego na GA, który został połączony z białkiem fluorescencyjnym i powszechnie wyrażany w tkankach, a także białka fluorescencyjnego niewrażliwego na GA. Wykazaliśmy, że fuzje białka RGA zmutowanego nie zakłócają endogennej sygnalizacji GA, gdy są powszechnie wyrażane, i że ten biosensor może kwantyfikować aktywność sygnalizacyjną wynikającą zarówno z wejścia GA, jak i przetwarzania sygnału GA przez aparat wykrywający o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej. Użyliśmy tego biosensora do mapowania czasoprzestrzennego rozkładu aktywności sygnalizacyjnej GA i kwantyfikowania, w jaki sposób GA reguluje zachowanie komórkowe w naskórku SAM. Wykazaliśmy, że GA reguluje orientację płaszczyzny podziału komórek SAM znajdujących się między zawiązkami organów, definiując w ten sposób kanoniczną organizację komórkową międzywęźla.
Na koniec zapytaliśmy, czy qmRGA może raportować zmiany w endogennych poziomach GA przy użyciu rosnących hipokotyli. Wcześniej pokazaliśmy, że azotan stymuluje wzrost poprzez zwiększenie syntezy GA i, w konsekwencji, degradacji DELLA34. W związku z tym zaobserwowaliśmy, że długość hipokotylu w siewkach pUBQ10::qmRGA uprawianych w warunkach obfitego zaopatrzenia w azotany (10 mM NO3−) była znacznie dłuższa niż w siewkach uprawianych w warunkach niedoboru azotanów (Rys. uzupełniający 6a). Zgodnie z reakcją wzrostową, sygnały GA były wyższe w hipokotylach siewek uprawianych w warunkach 10 mM NO3− niż w siewkach uprawianych bez azotanów (Rys. uzupełniający 6b, c). Zatem qmRGA umożliwia również monitorowanie zmian w sygnalizacji GA wywołanych przez endogenne zmiany stężenia GA.
Aby zrozumieć, czy aktywność sygnalizacyjna GA wykryta przez qmRGA zależy od stężenia GA i percepcji GA, jak oczekiwano na podstawie konstrukcji czujnika, przeanalizowaliśmy ekspresję trzech receptorów GID1 w tkankach wegetatywnych i rozrodczych. W siewkach linia reporterowa GID1-GUS wykazała, że GID1a i c były silnie ekspresjonowane w liścieniach (ryc. 3a–c). Ponadto wszystkie trzy receptory były ekspresjonowane w liściach, zawiązkach korzeni bocznych, końcówkach korzeni (z wyjątkiem czapeczki korzeniowej GID1b) i układzie naczyniowym (ryc. 3a–c). W kwiatostanie SAM wykryliśmy sygnały GUS tylko dla GID1b i 1c (rys. uzupełniający 7a–c). Hybrydyzacja in situ potwierdziła te wzorce ekspresji i dodatkowo wykazała, że GID1c był równomiernie ekspresjonowany na niskich poziomach w SAM, podczas gdy GID1b wykazywał wyższą ekspresję na obwodzie SAM (rys. uzupełniający 7d–l). Fuzja translacyjna pGID1b::2xmTQ2-GID1b ujawniła również stopniowany zakres ekspresji GID1b, od niskiej lub braku ekspresji w centrum SAM do wysokiej ekspresji na granicach organów (Rys. uzupełniający 7m). Zatem receptory GID1 nie są równomiernie rozmieszczone w tkankach i wewnątrz nich. W kolejnych eksperymentach zaobserwowaliśmy również, że nadmierna ekspresja GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) zwiększyła wrażliwość qmRGA w hipokotylach na zewnętrzną aplikację GA (Rys. 3d, e). Natomiast fluorescencja mierzona przez qd17mRGA w hipokotylu była niewrażliwa na leczenie GA3 (Rys. 3f, g). W przypadku obu testów siewki traktowano wysokimi stężeniami GA (100 μM GA3), aby ocenić szybkie zachowanie czujnika, w którym zdolność wiązania się z receptorem GID1 była zwiększona lub utracona. Łącznie wyniki te potwierdzają, że biosensor qmRGA pełni łączną funkcję czujnika GA i GA, i sugerują, że różnicowa ekspresja receptora GID1 może znacząco modulować emisyjność czujnika.
Do tej pory rozkład sygnałów GA w SAM pozostaje niejasny. Dlatego też użyliśmy roślin eksprymujących qmRGA i reportera komórek macierzystych pCLV3::mCherry-NLS35 do obliczenia map ilościowych o wysokiej rozdzielczości aktywności sygnalizacyjnej GA, skupiając się na warstwie L1 (naskórek; rys. 4a, b, patrz Metody i metody uzupełniające), ponieważ L1 odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu wzrostu SAM36. W tym przypadku ekspresja pCLV3::mCherry-NLS zapewniła stały geometryczny punkt odniesienia do analizy rozkładu przestrzenno-czasowego aktywności sygnalizacyjnej GA37. Chociaż GA jest uważane za niezbędne do rozwoju organów bocznych4, zaobserwowaliśmy, że sygnały GA były niskie w zawiązku kwiatowym (P) począwszy od etapu P3 (rys. 4a, b), podczas gdy młode zawiązki P1 i P2 miały umiarkowaną aktywność podobną do tej w regionie centralnym (rys. 4a, b). Wyższą aktywność sygnalizacyjną GA wykryto na granicach zawiązków organów, zaczynając od P1/P2 (po bokach granicy) i osiągając szczyt w P4, jak również we wszystkich komórkach regionu obwodowego zlokalizowanego między zawiązkami (Rys. 4a, b i Rys. uzupełniający 8a, b). Tę wyższą aktywność sygnalizacyjną GA obserwowano nie tylko w naskórku, ale także w warstwach L2 i górnej L3 (Rys. uzupełniający 8b). Wzór sygnałów GA wykrytych w SAM przy użyciu qmRGA również pozostał niezmieniony w czasie (Rys. uzupełniający 8c–f, k). Chociaż konstrukcja qd17mRGA była systematycznie zmniejszana w SAM roślin T3 z pięciu niezależnych linii, które szczegółowo scharakteryzowaliśmy, byliśmy w stanie przeanalizować wzory fluorescencji uzyskane przy użyciu konstrukcji pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Rys. uzupełniający 8g–j, l). W tej linii kontrolnej wykryto jedynie niewielkie zmiany w stosunku fluorescencji w SAM, ale w centrum SAM zaobserwowaliśmy wyraźny i nieoczekiwany spadek VENUS związany z TagBFP. Potwierdza to, że wzór sygnalizacji obserwowany przez qmRGA odzwierciedla zależną od GA degradację mRGA-VENUS, ale również pokazuje, że qmRGA może przeceniać aktywność sygnalizacji GA w centrum merystemu. Podsumowując, nasze wyniki ujawniają wzór sygnalizacji GA, który odzwierciedla przede wszystkim rozmieszczenie zawiązków. Ten rozkład regionu między zawiązkami (IPR) wynika ze stopniowego ustanawiania wysokiej aktywności sygnalizacji GA między rozwijającym się zawiązkiem a regionem centralnym, podczas gdy w tym samym czasie aktywność sygnalizacji GA w zawiązku spada (ryc. 4c, d).
Dystrybucja receptorów GID1b i GID1c (patrz powyżej) sugeruje, że różnicowa ekspresja receptorów GA pomaga kształtować wzorzec aktywności sygnalizacyjnej GA w SAM. Zastanawialiśmy się, czy może być zaangażowana różnicowa akumulacja GA. Aby zbadać tę możliwość, użyliśmy czujnika GA FRET nlsGPS121. Zwiększoną częstotliwość aktywacji wykryto w SAM nlsGPS1 traktowanego 10 μM GA4+7 przez 100 min (Rys. uzupełniający 9a–e), co wskazuje, że nlsGPS1 reaguje na zmiany stężenia GA w SAM, tak jak w korzeniach21. Przestrzenny rozkład częstotliwości aktywacji nlsGPS1 ujawnił stosunkowo niskie poziomy GA w zewnętrznych warstwach SAM, ale pokazał, że były one podwyższone w centrum i na granicach SAM (Rys. 4e i Rys. uzupełniający 9a,c). Sugeruje to, że GA jest również rozprowadzany w SAM z przestrzennym wzorem porównywalnym do tego ujawnionego przez qmRGA. Jako podejście uzupełniające, potraktowaliśmy również SAM fluorescencyjnym GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) lub Fl w pojedynkę jako kontrolę negatywną. Sygnał Fl był rozprowadzany w całym SAM, w tym w regionie centralnym i zawiązku, choć z niższą intensywnością (Rys. 4j i Ryc. uzupełniający 10d). Natomiast wszystkie trzy GA-Fl gromadziły się specyficznie w granicach zawiązku i w różnym stopniu w pozostałej części IPR, przy czym GA7-Fl gromadził się w największej domenie w IPR (Rys. 4k i Ryc. uzupełniający 10a,b). Kwantyfikacja intensywności fluorescencji wykazała, że stosunek intensywności IPR do nie-IPR był wyższy w SAM leczonym GA-Fl w porównaniu z SAM leczonym Fl (Rys. 4l i Ryc. uzupełniający 10c). Łącznie te wyniki sugerują, że GA występuje w wyższych stężeniach w komórkach IPR, które znajdują się najbliżej granicy narządu. Sugeruje to, że wzór aktywności sygnalizacyjnej SAM GA wynika zarówno z różnicowej ekspresji receptorów GA, jak i różnicowej akumulacji GA w komórkach IPR w pobliżu granic narządu. Tak więc nasza analiza ujawniła nieoczekiwany przestrzenno-czasowy wzór sygnalizacji GA, z niższą aktywnością w centrum i zawiązku SAM oraz wyższą aktywnością w IPR w regionie obwodowym.
Aby zrozumieć rolę różnicowej aktywności sygnalizacyjnej GA w SAM, przeanalizowaliśmy korelację między aktywnością sygnalizacyjną GA, ekspansją komórek i podziałem komórek, wykorzystując obrazowanie poklatkowe w czasie rzeczywistym SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Biorąc pod uwagę rolę GA w regulacji wzrostu, oczekiwano dodatniej korelacji z parametrami ekspansji komórek. Dlatego najpierw porównaliśmy mapy aktywności sygnalizacyjnej GA z mapami tempa wzrostu powierzchni komórek (jako wskaźnika siły ekspansji komórek dla danej komórki i komórek potomnych w momencie podziału) oraz z mapami anizotropii wzrostu, które mierzą kierunkowość ekspansji komórek (również stosowane tutaj dla danej komórki i komórek potomnych w momencie podziału; rys. 5a, b, patrz Metody i metody uzupełniające). Nasze mapy tempa wzrostu powierzchni komórek SAM są zgodne z poprzednimi obserwacjami38,39, z minimalnymi tempami wzrostu na granicy i maksymalnymi tempami wzrostu w rozwijających się kwiatach (rys. 5a). Analiza głównych składowych (PCA) wykazała, że aktywność sygnalizacji GA była negatywnie skorelowana z intensywnością wzrostu powierzchni komórki (rysunek 5c). Wykazaliśmy również, że główne osie zmienności, w tym sygnał wejściowy GA i intensywność wzrostu, były ortogonalne do kierunku określonego przez wysoką ekspresję CLV3, co potwierdza wykluczenie komórek z centrum SAM w pozostałych analizach. Analiza korelacji Spearmana potwierdziła wyniki PCA (rysunek 5d), wskazując, że wyższe sygnały GA w IPR nie skutkowały większą ekspansją komórek. Jednak analiza korelacji wykazała niewielką dodatnią korelację między aktywnością sygnalizacji GA a anizotropią wzrostu (rysunek 5c, d), co sugeruje, że wyższa sygnalizacja GA w IPR wpływa na kierunek wzrostu komórek i prawdopodobnie na położenie płaszczyzny podziału komórki.
a, b Mapy cieplne średniego wzrostu powierzchni (a) i anizotropii wzrostu (b) w SAM uśrednione dla siedmiu niezależnych roślin (używane jako wskaźniki siły i kierunku ekspansji komórek, odpowiednio). c Analiza PCA obejmowała następujące zmienne: sygnał GA, intensywność wzrostu powierzchni, anizotropię wzrostu powierzchni i ekspresję CLV3. Składnik PCA 1 był głównie negatywnie skorelowany z intensywnością wzrostu powierzchni i pozytywnie skorelowany z sygnałem GA. Składnik PCA 2 był głównie pozytywnie skorelowany z anizotropią wzrostu powierzchni i negatywnie skorelowany z ekspresją CLV3. Procenty przedstawiają zmienność wyjaśnioną przez każdy składnik. d Analiza korelacji Spearmana między sygnałem GA, intensywnością wzrostu powierzchni i anizotropią wzrostu powierzchni w skali tkanki z wyłączeniem CZ. Liczba po prawej stronie to wartość rho Spearmana między dwiema zmiennymi. Gwiazdki oznaczają przypadki, w których korelacja/negatywna korelacja jest wysoce istotna. e Wizualizacja 3D komórek Col-0 SAM L1 za pomocą mikroskopii konfokalnej. Nowe ściany komórkowe utworzone w SAM (ale nie w zawiązku) po 10 h są kolorowane zgodnie z ich wartościami kątowymi. Pasek kolorów jest pokazany w prawym dolnym rogu. Wstawka pokazuje odpowiadający obraz 3D po 0 h. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami. f Wykresy pudełkowe pokazują wskaźniki podziału komórek w IPR i nie-IPR Col-0 SAM (n = 10 niezależnych roślin). Linia środkowa pokazuje medianę, a granice pola wskazują 25. i 75. percentyl. Wąsy wskazują wartości minimalne i maksymalne określone za pomocą oprogramowania R. Wartości p uzyskano za pomocą dwustronnego testu t Welcha. g, h Schematyczny diagram pokazujący (g) sposób pomiaru kąta nowej ściany komórkowej (magenta) względem kierunku promieniowego od środka SAM (biała linia przerywana) (rozważane są tylko ostre wartości kątów, tj. 0–90°) oraz (h) kierunki obwodowy/boczny i promieniowy w merystemie. i Histogramy częstotliwości orientacji płaszczyzny podziału komórek w poprzek SAM (ciemnoniebieski), IPR (średnioniebieski) i nie-IPR (jasnoniebieski). Wartości p uzyskano za pomocą dwustronnego testu Kołmogorowa-Smirnowa. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami. j Histogramy częstotliwości orientacji płaszczyzny podziału komórek IPR wokół P3 (jasnozielony), P4 (średniozielony) i P5 (ciemnozielony). Wartości p uzyskano za pomocą dwustronnego testu Kołmogorowa-Smirnowa. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami.
Dlatego też, następnie zbadaliśmy korelację między sygnalizacją GA a aktywnością podziału komórek poprzez identyfikację nowo utworzonych ścian komórkowych podczas testu (rys. 5e). To podejście pozwoliło nam zmierzyć częstotliwość i kierunek podziału komórek. Ku naszemu zaskoczeniu odkryliśmy, że częstotliwość podziałów komórek w IPR i reszcie SAM (nie-IPR, rys. 5f) była podobna, co wskazuje, że różnice w sygnalizacji GA między komórkami IPR i nie-IPR nie wpływają znacząco na podział komórek. To, a także dodatnia korelacja między sygnalizacją GA a anizotropią wzrostu, skłoniły nas do rozważenia, czy aktywność sygnalizacji GA może wpływać na orientację płaszczyzny podziału komórek. Zmierzyliśmy orientację nowej ściany komórkowej jako kąt ostry względem osi promieniowej łączącej środek merystemu i środek nowej ściany komórkowej (rys. 5e-i) i zaobserwowaliśmy wyraźną tendencję komórek do podziału pod kątami bliskimi 90° względem osi promieniowej, przy czym najwyższe częstotliwości zaobserwowano przy 70–80° (23,28%) i 80–90° (22,62%) (rys. 5e,i), co odpowiada podziałom komórek w kierunku obwodowym/poprzecznym (rys. 5h). Aby zbadać udział sygnalizacji GA w tym zachowaniu podziału komórek, przeanalizowaliśmy parametry podziału komórek w IPR i nie-IPR oddzielnie (rys. 5i). Zaobserwowaliśmy, że rozkład kąta podziału w komórkach IPR różnił się od rozkładu w komórkach nie-IPR lub w komórkach w całym SAM, przy czym komórki IPR wykazywały wyższy odsetek podziałów bocznych/kołowych, tj. 70–80° i 80–90° (odpowiednio 33,86% i 30,71%, odpowiadające sobie proporcje) (Rys. 5i). Tak więc nasze obserwacje ujawniły związek między wysokim sygnałem GA a orientacją płaszczyzny podziału komórki blisko kierunku obwodowego, podobnie do korelacji między aktywnością sygnałową GA a anizotropią wzrostu (Rys. 5c, d). Aby dodatkowo ustalić zachowanie przestrzenne tego związku, zmierzyliśmy orientację płaszczyzny podziału w komórkach IPR otaczających zawiązek, zaczynając od P3, ponieważ najwyższą aktywność sygnałową GA wykryto w tym regionie, zaczynając od P4 (Rys. 4). Kąty podziału IPR wokół P3 i P4 nie wykazały statystycznie istotnych różnic, chociaż zaobserwowano zwiększoną częstość bocznych podziałów komórek w IPR wokół P4 (rys. 5j). Jednak w komórkach IPR wokół P5 różnica w orientacji płaszczyzny podziału komórek stała się statystycznie istotna, ze znacznym wzrostem częstości poprzecznych podziałów komórek (rys. 5j). Łącznie te wyniki sugerują, że sygnalizacja GA może kontrolować orientację podziałów komórek w SAM, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami40,41, że wysoka sygnalizacja GA może indukować boczną orientację podziałów komórek w IPR.
Przewiduje się, że komórki w IPR nie zostaną włączone do zawiązków, ale raczej do międzywęźli2,42,43. Poprzeczna orientacja podziałów komórkowych w IPR może skutkować typową organizacją równoległych, podłużnych rzędów komórek epidermy w międzywęźlach. Nasze obserwacje opisane powyżej sugerują, że sygnalizacja GA prawdopodobnie odgrywa rolę w tym procesie, regulując kierunek podziału komórek.
Utrata funkcji kilku genów DELLA skutkuje konstytutywną odpowiedzią GA, a mutanty della mogą być użyte do przetestowania tej hipotezy44. Najpierw przeanalizowaliśmy wzorce ekspresji pięciu genów DELLA w SAM. Fuzja transkrypcyjna linii GUS45 wykazała, że GAI, RGA, RGL1 i RGL2 (w znacznie mniejszym stopniu) były wyrażane w SAM (Rys. uzupełniający 11a–d). Hybrydyzacja in situ wykazała ponadto, że mRNA GAI gromadzi się specyficznie w zawiązkach i rozwijających się kwiatach (Rys. uzupełniający 11e). mRNA RGL1 i RGL3 wykryto w całym baldachimie SAM i w starszych kwiatach, podczas gdy mRNA RGL2 było bardziej obfite w regionie granicznym (Rys. uzupełniający 11f–h). Konfokalne obrazowanie pRGL3::RGL3-GFP SAM potwierdziło ekspresję obserwowaną w hybrydyzacji in situ i wykazało, że białko RGL3 gromadzi się w centralnej części SAM (Rys. uzupełniający 11i). Używając linii pRGA::GFP-RGA, odkryliśmy również, że białko RGA gromadzi się w SAM, ale jego obfitość zmniejsza się na granicy począwszy od P4 (Rys. uzupełniający 11j). Co godne uwagi, wzorce ekspresji RGL3 i RGA są zgodne z wyższą aktywnością sygnalizacji GA w IPR, jak wykryto za pomocą qmRGA (Rys. 4). Ponadto dane te wskazują, że wszystkie DELLA są wyrażane w SAM i że ich ekspresja łącznie obejmuje cały SAM.
Następnie przeanalizowaliśmy parametry podziału komórek w dzikim typie SAM (Ler, kontrola) i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globalne) mutanty (rys. 6a, b). Co ciekawe, zaobserwowaliśmy statystycznie istotną zmianę w rozkładzie częstości kątów podziału komórek w della global mutant SAM w porównaniu z dzikim typem (rys. 6c). Ta zmiana w della global mutant była spowodowana wzrostem częstości kątów 80–90° (34,71% w porównaniu z 24,55%) i, w mniejszym stopniu, kątów 70–80° (23,78% w porównaniu z 20,18%), tj. odpowiadających poprzecznym podziałom komórek (rys. 6c). Częstotliwość podziałów niepoprzecznych (0–60°) była również niższa w della global mutant (rys. 6c). Częstotliwość poprzecznych podziałów komórek była znacząco zwiększona w SAM mutanta della global (rys. 6b). Częstotliwość poprzecznych podziałów komórek w IPR była również wyższa w mutancie della global w porównaniu z typem dzikim (rys. 6d). Poza regionem IPR, typ dziki miał bardziej równomierny rozkład kątów podziału komórek, podczas gdy mutant della global preferował podziały styczne, takie jak IPR (rys. 6e). Określiliśmy również ilościowo orientację podziałów komórek w SAM mutantów kwintetu oksydazy ga2 (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 i ga2ox6-2), nieaktywnego GA tła mutanta, w którym GA się kumuluje. Zgodnie ze wzrostem poziomów GA, SAM kwiatostanu mutanta ga2ox z pięciokrotnym wiązaniem był większy niż w przypadku Col-0 (rys. uzupełniający 12a, b), a w porównaniu do Col-0, SAM z pięciokrotnym wiązaniem ga2ox wykazywał wyraźnie inny rozkład kątów podziału komórek, przy czym częstość kątów wzrastała z 50° do 90°, tj. ponownie sprzyjając podziałom stycznym (rys. uzupełniający 12a–c). W ten sposób pokazujemy, że konstytutywna aktywacja sygnalizacji GA i akumulacja GA indukują boczne podziały komórek w IPR i reszcie SAM.
a, b Wizualizacja 3D warstwy L1 barwionego PI Ler (a) i globalnego della mutanta (b) SAM przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Nowe ściany komórkowe utworzone w SAM (ale nie zawiązek) w okresie 10 godzin są pokazane i pokolorowane zgodnie z ich wartościami kątowymi. Wstawka pokazuje SAM w godzinie 0. Pasek kolorów jest wyświetlany w prawym dolnym rogu. Strzałka w (b) wskazuje na przykład wyrównanych plików komórek w globalnym della mutant. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami. ce porównanie rozkładu częstości orientacji płaszczyzny podziału komórek w całym SAM (d), IPR (e) i nie-IPR (f) między Ler i globalnym della. Wartości p uzyskano przy użyciu dwustronnego testu Kołmogorowa-Smirnowa. f, g Wizualizacja 3D obrazów konfokalnych barwionej PI SAM roślin transgenicznych Col-0 (i) i pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panele (a, b) przedstawiają nowe ściany komórkowe (ale nie zawiązki) utworzone w SAM w ciągu 10 h. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami. h–j Porównanie rozkładu częstości orientacji płaszczyzny podziału komórek zlokalizowanych w całej SAM (h), IPR (i) i nie-IPR (j) między roślinami Col-0 i pCUC2::gai-1-VENUS. Wartości p uzyskano przy użyciu dwustronnego testu Kołmogorowa–Smirnowa.
Następnie przetestowaliśmy efekt hamowania sygnalizacji GA specyficznie w IPR. W tym celu użyliśmy promotora cotyledon cup 2 (CUC2) do napędzania ekspresji dominującego negatywnego białka gai-1 połączonego z VENUS (w linii pCUC2::gai-1-VENUS). W dzikim typie SAM promotor CUC2 napędza ekspresję większości IPR w SAM, w tym komórek granicznych, od P4 wzwyż, a podobną specyficzną ekspresję obserwowano w roślinach pCUC2::gai-1-VENUS (patrz poniżej). Dystrybucja kątów podziału komórek w SAM lub IPR roślin pCUC2::gai-1-VENUS nie różniła się znacząco od tej w dzikim typie, chociaż nieoczekiwanie odkryliśmy, że komórki bez IPR w tych roślinach dzieliły się z wyższą częstotliwością 80–90° (ryc. 6f–j).
Zasugerowano, że kierunek podziału komórek zależy od geometrii SAM, w szczególności naprężenia rozciągającego generowanego przez krzywiznę tkanki46. Dlatego też zapytaliśmy, czy kształt SAM został zmieniony w roślinach della global mutant i pCUC2::gai-1-VENUS. Jak wcześniej zgłoszono12, rozmiar della global mutant SAM był większy niż dzikiego typu (Rysunek uzupełniający 13a, b, d). Hybrydyzacja in situ CLV3 i STM RNA potwierdziła ekspansję merystemu w mutantach della i dodatkowo wykazała boczną ekspansję niszy komórek macierzystych (Rysunek uzupełniający 13e, f, h, i). Jednak krzywizna SAM była podobna w obu genotypach (Rysunek uzupełniający 13k, m, n, p). Zaobserwowaliśmy podobny wzrost wielkości w mutancie gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple bez zmiany krzywizny w porównaniu z typem dzikim (Rys. uzupełniający 13c, d, g, j, l, o, p). Częstotliwość orientacji podziału komórek była również zmieniona w mutancie della quadruple, ale w mniejszym stopniu niż w mutancie della monolitycznym (Rys. uzupełniający 12d–f). Ten efekt dawkowania, wraz z brakiem wpływu na krzywiznę, sugeruje, że resztkowa aktywność RGL3 w mutancie Della quadruple ogranicza zmiany w orientacji podziału komórek spowodowane utratą aktywności DELLA i że zmiany w bocznych podziałach komórek występują w odpowiedzi na zmiany w aktywności sygnalizacji GA, a nie zmiany w geometrii SAM. Jak opisano powyżej, promotor CUC2 napędza ekspresję IPR w SAM począwszy od P4 (Rys. uzupełniający 14a, b), natomiast pCUC2::gai-1-VENUS SAM miał zmniejszony rozmiar, ale większą krzywiznę (Rys. uzupełniający 14c–h). Ta zmiana w morfologii pCUC2::gai-1-VENUS SAM może skutkować innym rozkładem naprężeń mechanicznych w porównaniu z typem dzikim, w którym wysokie naprężenia obwodowe zaczynają się w krótszej odległości od środka SAM47. Alternatywnie, zmiany w morfologii pCUC2::gai-1-VENUS SAM mogą wynikać ze zmian regionalnych właściwości mechanicznych wywołanych przez ekspresję transgenu48. W obu przypadkach może to częściowo zniwelować skutki zmian w sygnalizacji GA poprzez zwiększenie prawdopodobieństwa, że komórki podzielą się w orientacji obwodowej/poprzecznej, co wyjaśnia nasze obserwacje.
Łącznie nasze dane potwierdzają, że wyższy poziom sygnalizacji GA odgrywa aktywną rolę w bocznej orientacji płaszczyzny podziału komórek w IPR. Pokazują również, że krzywizna merystemu wpływa również na orientację płaszczyzny podziału komórek w IPR.
Poprzeczna orientacja płaszczyzny podziału w IPR, spowodowana wysoką aktywnością sygnalizacyjną GA, sugeruje, że GA wstępnie organizuje promienisty plik komórek w naskórku w obrębie SAM, aby zdefiniować organizację komórkową, która później zostanie znaleziona w międzywęźle naskórkowym. Rzeczywiście, takie pliki komórek były często widoczne na obrazach SAM mutantów della global (ryc. 6b). Tak więc, aby dalej badać funkcję rozwojową przestrzennego wzorca sygnalizacji GA w SAM, użyliśmy obrazowania poklatkowego do analizy przestrzennej organizacji komórek w IPR w dzikim typie (Ler i Col-0), mutantach della global i roślinach transgenicznych pCUC2::gai-1-VENUS.
Odkryliśmy, że qmRGA wykazało, że aktywność sygnalizacyjna GA w IPR wzrastała od P1/P2 i osiągnęła szczyt w P4, a ten wzór pozostawał stały w czasie (ryc. 4a–f i ryc. uzupełniająca 8c–f, k). Aby przeanalizować organizację przestrzenną komórek w IPR ze wzrastającym sygnałem GA, oznaczyliśmy komórki Ler IPR powyżej i po bokach P4 zgodnie z ich losem rozwojowym analizowanym 34 godziny po pierwszej obserwacji, tj. ponad dwa czasy plastydowe, co pozwoliło nam śledzić komórki IPR podczas rozwoju zawiązku od P1/P2 do P4. Użyliśmy trzech różnych kolorów: żółtego dla tych komórek, które zostały zintegrowane z zawiązkiem w pobliżu P4, zielonego dla tych, które znajdowały się w IPR i fioletowego dla tych, które uczestniczyły w obu procesach (ryc. 7a–c). W t0 (0 h) 1–2 warstwy komórek IPR były widoczne przed P4 (ryc. 7a). Zgodnie z oczekiwaniami, gdy te komórki się dzieliły, robiły to głównie poprzez płaszczyznę podziału poprzecznego (rys. 7a–c). Podobne wyniki uzyskano przy użyciu Col-0 SAM (skupiając się na P3, którego granica fałduje się podobnie do P4 w Ler), chociaż w tym genotypie fałd utworzony na granicy kwiatowej szybciej ukrywał komórki IPR (rys. 7g–i). Tak więc wzór podziału komórek IPR wstępnie organizuje komórki w rzędy promieniowe, jak w międzywęźlach. Organizacja rzędów promieniowych i lokalizacja komórek IPR między kolejnymi organami sugerują, że te komórki są progenitorami międzywęzłowymi.
Tutaj opracowaliśmy ratiometryczny biosensor sygnalizacji GA, qmRGA, który umożliwia ilościowe mapowanie aktywności sygnalizacji GA wynikającej z połączonych stężeń GA i receptora GA, jednocześnie minimalizując zakłócenia endogennych szlaków sygnałowych, dostarczając w ten sposób informacji o funkcji GA na poziomie komórkowym. W tym celu skonstruowaliśmy zmodyfikowane białko DELLA, mRGA, które utraciło zdolność wiązania partnerów interakcji DELLA, ale pozostaje wrażliwe na proteolizę indukowaną przez GA. qmRGA reaguje zarówno na egzogenne, jak i endogenne zmiany poziomów GA, a jego dynamiczne właściwości wykrywania umożliwiają ocenę przestrzenno-czasowych zmian aktywności sygnalizacji GA w trakcie rozwoju. qmRGA jest również bardzo elastycznym narzędziem, ponieważ można je dostosować do różnych tkanek, zmieniając promotor używany do jego ekspresji (jeśli to konieczne), a biorąc pod uwagę konserwatywny charakter szlaku sygnalizacji GA i motywu PFYRE w okrytonasiennych, prawdopodobnie będzie można je przenieść na inne gatunki22. Zgodnie z tym wykazano, że równoważna mutacja w białku DELLA SLR1 ryżu (HYY497AAA) również tłumi aktywność represora wzrostu SLR1, jednocześnie nieznacznie zmniejszając jego degradację pośredniczoną przez GA, podobnie jak w przypadku mRGA23. Co ciekawe, ostatnie badania w Arabidopsis wykazały, że pojedyncza mutacja aminokwasu w domenie PFYRE (S474L) zmieniła aktywność transkrypcyjną RGA bez wpływu na jego zdolność do interakcji z partnerami czynników transkrypcyjnych50. Chociaż mutacja ta jest bardzo bliska 3 substytucjom aminokwasów obecnym w mRGA, nasze badania pokazują, że te dwie mutacje zmieniają odrębne cechy DELLA. Chociaż większość partnerów czynników transkrypcyjnych wiąże się z domenami LHR1 i SAW DELLA26,51, niektóre konserwatywne aminokwasy w domenie PFYRE mogą pomóc ustabilizować te interakcje.
Rozwój międzywęźli jest kluczową cechą w architekturze roślin i poprawie plonów. qmRGA ujawniło wyższą aktywność sygnalizacyjną GA w komórkach progenitorowych międzywęźli IPR. Łącząc obrazowanie ilościowe i genetykę, wykazaliśmy, że wzorce sygnalizacji GA nakładają się na koliste/poprzeczne płaszczyzny podziału komórek w naskórku SAM, kształtując organizację podziału komórek wymaganą do rozwoju międzywęźli. Podczas rozwoju zidentyfikowano kilka regulatorów orientacji płaszczyzny podziału komórek52,53. Nasza praca dostarcza jasnego przykładu, w jaki sposób aktywność sygnalizacji GA reguluje ten parametr komórkowy. DELLA może oddziaływać z kompleksami białek prefoldingowych41, więc sygnalizacja GA może regulować orientację płaszczyzny podziału komórek, bezpośrednio wpływając na orientację mikrotubul korowych40,41,54,55. Nieoczekiwanie wykazaliśmy, że w SAM korelatem wyższej aktywności sygnalizacji GA nie było wydłużenie ani podział komórek, ale tylko anizotropia wzrostu, co jest zgodne z bezpośrednim wpływem GA na kierunek podziału komórek w IPR. Nie możemy jednak wykluczyć, że efekt ten może być również pośredni, na przykład pośredniczony przez indukowane przez GA zmiękczanie ścian komórkowych56. Zmiany właściwości ścian komórkowych wywołują naprężenie mechaniczne57,58, które może również wpływać na orientację płaszczyzny podziału komórkowego poprzez wpływ na orientację mikrotubul korowych39,46,59. Połączone efekty naprężenia mechanicznego indukowanego przez GA i bezpośredniej regulacji orientacji mikrotubul przez GA mogą być zaangażowane w generowanie określonego wzorca orientacji podziału komórkowego w IPR w celu zdefiniowania międzywęźli, a dalsze badania są potrzebne do przetestowania tej idei. Podobnie, poprzednie badania podkreśliły znaczenie białek TCP14 i 15 oddziałujących z DELLA w kontroli formowania międzywęźli60,61, a czynniki te mogą pośredniczyć w działaniu GA wraz z BREVIPEDICELLUS (BP) i PENNYWISE (PNY), które regulują rozwój międzywęźli i wykazano, że wpływają na sygnalizację GA2,62. Biorąc pod uwagę, że DELLA oddziałują ze szlakami sygnałowymi brassinosteroidów, etylenu, kwasu jasmonowego i kwasu abscysynowego (ABA)63,64 i że hormony te mogą wpływać na orientację mikrotubul65, wpływ GA na orientację podziału komórek może być również pośredniczony przez inne hormony.
Wczesne badania cytologiczne wykazały, że zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne obszary SAM Arabidopsis są wymagane do rozwoju międzywęźli2,42. Fakt, że GA aktywnie reguluje podział komórek w tkankach wewnętrznych12 potwierdza podwójną funkcję GA w regulacji merystemu i rozmiaru międzywęźli w SAM. Wzór kierunkowego podziału komórek jest również ściśle regulowany w wewnętrznej tkance SAM, a regulacja ta jest niezbędna do wzrostu łodygi52. Będzie interesujące zbadanie, czy GA odgrywa również rolę w orientowaniu płaszczyzny podziału komórek w wewnętrznej organizacji SAM, synchronizując w ten sposób specyfikację i rozwój międzywęźli w SAM.
Rośliny hodowano in vitro w glebie lub podłożu 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) uzupełnionym o 1% sacharozy i 1% agaru (Sigma) w standardowych warunkach (16 h światła, 22 °C), z wyjątkiem eksperymentów wzrostu hipokotylu i korzeni, w których siewki hodowano na pionowych płytkach przy stałym świetle i 22 °C. W przypadku eksperymentów z azotanami rośliny hodowano na zmodyfikowanym podłożu MS (podłoże roślinne bioWORLD) uzupełnionym odpowiednią ilością azotanów (0 lub 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-bursztynianu, 1% sacharozy i 1% A-agaru (Sigma) w warunkach długiego dnia.
cDNA GID1a wstawione do pDONR221 zostało zrekombinowane z pDONR P4-P1R-pUBQ10 i pDONR P2R-P3-mCherry do pB7m34GW w celu wygenerowania pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 wstawione do pDONR221 zostało zrekombinowane do pB7RWG266 w celu wygenerowania p35S:IDD2-RFP. Aby wygenerować pGID1b::2xmTQ2-GID1b, najpierw amplifikowano fragment o długości 3,9 kb znajdujący się przed regionem kodującym GID1b oraz fragment o długości 4,7 kb zawierający cDNA GID1b (1,3 kb) i terminator (3,4 kb) przy użyciu starterów podanych w tabeli uzupełniającej 3, a następnie wstawiono odpowiednio do pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) i pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), a na koniec zrekombinowano z pDONR221 2xmTQ268 w wektorze docelowym pGreen 012567 przy użyciu klonowania Gateway. Aby wygenerować pCUC2::LSSmOrange, sekwencję promotora CUC2 (3229 pb w górę od ATG) po której następuje sekwencja kodująca dużego przesuniętego Stokesa mOrange (LSSmOrange)69 z sygnałem lokalizacji jądrowej N7 i terminatorem transkrypcji NOS zmontowano w wektorze docelowym kanamycyny pGreen przy użyciu systemu rekombinacji 3-fragmentów Gateway (Invitrogen). Roślinny wektor binarny wprowadzono do szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101 i wprowadzono do liści Nicotiana benthamiana metodą infiltracji Agrobacterium oraz do Arabidopsis thaliana Col-0 metodą zanurzania w kwiatach, odpowiednio. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry i pCLV3::mCherry-NLS qmRGA wyizolowano z potomstwa F3 i F1 odpowiednich krzyżówek, odpowiednio.
Hybrydyzację RNA in situ przeprowadzono na około 1 cm długości końcówkach pędów72, które zebrano i natychmiast utrwalono w roztworze FAA (3,7% formaldehydu, 5% kwasu octowego, 50% etanolu) wstępnie schłodzonym do 4 °C. Po 2 × 15 min. obróbce próżniowej wymieniono utrwalacz i próbki inkubowano przez noc. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 i RGL3 oraz sondy antysensowe do ich 3′-UTR zsyntetyzowano przy użyciu starterów przedstawionych w Tabeli uzupełniającej 3, zgodnie z opisem Rosier i in.73. Sondy znakowane digoksygeniną poddano immunodetekcji przy użyciu przeciwciał przeciwko digoksygeninie (rozcieńczenie 3000-krotne; Roche, numer katalogowy: 11 093 274 910), a skrawki barwiono roztworem 5-bromo-4-chloro-3-indolylofosforanu (BCIP, rozcieńczenie 250-krotne)/nitroblue tetrazolium (NBT, rozcieńczenie 200-krotne).
Czas publikacji: 10-02-2025