Wzrost merystemu wierzchołkowego pędu (SAM) jest kluczowy dla architektury łodygi. Hormony roślinnegiberelinyKwasy GA odgrywają kluczową rolę w koordynacji wzrostu roślin, ale ich rola w SAM pozostaje słabo poznana. W niniejszym opracowaniu opracowaliśmy ratiometryczny biosensor sygnalizacji GA, modyfikując białko DELLA w celu stłumienia jego istotnej funkcji regulacyjnej w odpowiedzi transkrypcyjnej GA, jednocześnie chroniąc jego degradację po rozpoznaniu GA. Wykazaliśmy, że ten biosensor oparty na degradacji dokładnie rejestruje zmiany poziomów GA i detekcji komórkowej podczas rozwoju. Wykorzystaliśmy ten biosensor do mapowania aktywności sygnalizacji GA w SAM. Wykazaliśmy, że wysokie sygnały GA występują głównie w komórkach zlokalizowanych między zawiązkami organów, które są prekursorami komórek międzywęźli. Wykorzystując podejścia oparte na zysku i utracie funkcji, wykazaliśmy ponadto, że GA reguluje orientację płaszczyzny podziału komórkowego, ustanawiając kanoniczną organizację komórkową międzywęźli, a tym samym promując specyfikację międzywęźli w SAM.
Merystem wierzchołkowy pędu (SAM), zlokalizowany na szczycie pędu, zawiera niszę komórek macierzystych, których aktywność generuje organy boczne i węzły łodygowe w sposób modularny i iteracyjny przez całe życie rośliny. Każda z tych powtarzających się jednostek, czyli węzłów roślinnych, zawiera międzywęźla i organy boczne w węzłach oraz merystemy pachowe w kątach liści1. Wzrost i organizacja węzłów roślinnych zmieniają się w trakcie rozwoju. U Arabidopsis wzrost międzywęźli jest hamowany w fazie wegetatywnej, a merystemy pachowe pozostają uśpione w kątach liści rozetowych. Podczas przejścia do fazy kwitnienia SAM staje się merystemem kwiatostanu, generując wydłużone międzywęźla i pąki pachowe, gałązki w kątach liści łodygowych, a później kwiaty bezlistne2. Chociaż poczyniliśmy znaczne postępy w zrozumieniu mechanizmów kontrolujących rozwój liści, kwiatów i gałęzi, stosunkowo niewiele wiemy o tym, w jaki sposób powstają międzywęźla.
Zrozumienie czasoprzestrzennego rozkładu GA pomoże lepiej zrozumieć funkcje tych hormonów w różnych tkankach i na różnych etapach rozwoju. Wizualizacja degradacji fuzji RGA-GFP, ekspresjonowanej pod wpływem własnego promotora, dostarcza ważnych informacji na temat regulacji całkowitego poziomu GA w korzeniach15,16. Jednak ekspresja RGA jest zróżnicowana w różnych tkankach17 i jest regulowana przez GA18. Zatem zróżnicowana ekspresja promotora RGA może skutkować wzorem fluorescencji obserwowanym dla RGA-GFP, a zatem ta metoda nie jest ilościowa. Niedawno bioaktywnie znakowane fluoresceiną (Fl) GA19,20 ujawniło akumulację GA w endokorteksie korzenia i regulację jego poziomu komórkowego poprzez transport GA. Niedawno czujnik GA FRET nlsGPS1 wykazał, że poziomy GA korelują z elongacją komórek w korzeniach, włóknach i ciemnych hipokotyli21. Jednakże, jak widzieliśmy, stężenie GA nie jest jedynym parametrem kontrolującym aktywność sygnalizacyjną GA, ponieważ zależy od złożonych procesów wykrywania. W niniejszym artykule, opierając się na naszej wiedzy na temat szlaków sygnałowych DELLA i GA, przedstawiamy opracowanie i charakterystykę opartego na degradacji ratiometrycznego biosensora sygnalizacji GA. Aby opracować ten ilościowy biosensor, wykorzystaliśmy zmutowany RGA wrażliwy na GA, który został połączony z białkiem fluorescencyjnym i jest powszechnie ekspresjonowany w tkankach, a także białko fluorescencyjne niewrażliwe na GA. Wykazaliśmy, że fuzje zmutowanego białka RGA nie zakłócają endogennej sygnalizacji GA, gdy jest powszechnie ekspresjonowany, oraz że ten biosensor może ilościowo określać aktywność sygnalizacyjną wynikającą zarówno z wejścia GA, jak i przetwarzania sygnału GA przez aparat czujnikowy z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Wykorzystaliśmy ten biosensor do mapowania czasoprzestrzennego rozkładu aktywności sygnalizacyjnej GA i ilościowego określenia, w jaki sposób GA reguluje zachowanie komórek w naskórku SAM. Wykazaliśmy, że GA reguluje orientację płaszczyzny podziału komórek SAM znajdujących się między zawiązkami organów, definiując w ten sposób kanoniczną organizację komórkową międzywęźla.
Na koniec zadaliśmy pytanie, czy qmRGA może rejestrować zmiany w endogennych poziomach GA z wykorzystaniem rosnących hipokotyli. Wcześniej wykazaliśmy, że azotany stymulują wzrost poprzez zwiększenie syntezy GA, a tym samym degradację DELLA34. W związku z tym zaobserwowaliśmy, że długość hipokotylu w siewkach pUBQ10::qmRGA uprawianych w warunkach obfitego nawożenia azotanami (10 mM NO3−) była istotnie większa niż w siewkach uprawianych w warunkach niedoboru azotanów (Rys. uzupełniający 6a). Zgodnie z reakcją wzrostową, sygnały GA były wyższe w hipokotylach siewek uprawianych w warunkach 10 mM NO3− niż w siewkach uprawianych bez azotanów (Rys. uzupełniający 6b, c). Zatem qmRGA umożliwia również monitorowanie zmian w sygnalizacji GA indukowanych przez endogenne zmiany stężenia GA.
Aby zrozumieć, czy aktywność sygnalizacyjna GA wykrywana przez qmRGA zależy od stężenia GA i jego percepcji, zgodnie z oczekiwaniami na podstawie konstrukcji czujnika, przeanalizowaliśmy ekspresję trzech receptorów GID1 w tkankach wegetatywnych i rozrodczych. U siewek linia reporterowa GID1-GUS wykazała wysoką ekspresję GID1a i c w liścieniach (ryc. 3a–c). Ponadto wszystkie trzy receptory były ekspresjonowane w liściach, zawiązkach korzeni bocznych, wierzchołkach korzeni (z wyjątkiem czapeczki korzeniowej GID1b) oraz w układzie naczyniowym (ryc. 3a–c). W warstwie SAM kwiatostanu wykryliśmy sygnały GUS tylko dla GID1b i 1c (ryc. uzupełniająca 7a–c). Hybrydyzacja in situ potwierdziła te wzorce ekspresji i dodatkowo wykazała, że GID1c był jednorodnie ekspresjonowany na niskim poziomie w warstwie SAM, podczas gdy GID1b wykazywał wyższą ekspresję na obrzeżach warstwy SAM (ryc. uzupełniająca 7d–l). Fuzja translacyjna pGID1b::2xmTQ2-GID1b ujawniła również zróżnicowany zakres ekspresji GID1b, od niskiej lub zerowej ekspresji w centrum SAM do wysokiej ekspresji na granicach narządów (rys. uzupełniający 7m). Zatem receptory GID1 nie są równomiernie rozmieszczone w tkankach i wewnątrz nich. W kolejnych eksperymentach zaobserwowaliśmy również, że nadmierna ekspresja GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) zwiększała wrażliwość qmRGA w hipokotylach na zewnętrzne zastosowanie GA (rys. 3d, e). Natomiast fluorescencja mierzona za pomocą qd17mRGA w hipokotylu była niewrażliwa na działanie GA3 (rys. 3f, g). W obu testach siewki traktowano wysokimi stężeniami GA (100 μM GA3) w celu oceny szybkiego zachowania czujnika, w którym zdolność wiązania się z receptorem GID1 była zwiększona lub utracona. Łącznie wyniki te potwierdzają, że biosensor qmRGA pełni połączoną funkcję czujnika GA i GA, i sugerują, że różnicowa ekspresja receptora GID1 może znacząco modulować emisyjność czujnika.
Do tej pory rozkład sygnałów GA w SAM pozostaje niejasny. Dlatego wykorzystaliśmy rośliny z ekspresją qmRGA oraz reporter komórek macierzystych pCLV3::mCherry-NLS35 do obliczenia map ilościowych aktywności sygnalizacyjnej GA o wysokiej rozdzielczości, koncentrując się na warstwie L1 (naskórek; ryc. 4a, b, patrz Metody i Metody Uzupełniające), ponieważ L1 odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu wzrostu SAM36. W tym przypadku ekspresja pCLV3::mCherry-NLS zapewniła stały geometryczny punkt odniesienia do analizy rozkładu czasoprzestrzennego aktywności sygnalizacyjnej GA37. Chociaż GA jest uważane za niezbędne do rozwoju organów bocznych4, zaobserwowaliśmy, że sygnały GA były niskie w zawiązku kwiatowym (P) począwszy od etapu P3 (ryc. 4a, b), podczas gdy młode zawiązki P1 i P2 wykazywały umiarkowaną aktywność, podobną do tej w regionie centralnym (ryc. 4a, b). Wyższą aktywność sygnalizacyjną GA wykryto na granicach zawiązków organów, począwszy od P1/P2 (po bokach granicy) i osiągając szczyt w P4, a także we wszystkich komórkach regionu obwodowego zlokalizowanego między zawiązkami (ryc. 4a, b i ryc. uzupełniająca 8a, b). Tę wyższą aktywność sygnalizacyjną GA zaobserwowano nie tylko w epidermie, ale także w warstwach L2 i górnej L3 (ryc. uzupełniająca 8b). Wzór sygnałów GA wykrytych w warstwie SAM za pomocą qmRGA również pozostał niezmieniony w czasie (ryc. uzupełniająca 8c–f, k). Chociaż konstrukt qd17mRGA był systematycznie zmniejszony w warstwie SAM roślin T3 z pięciu niezależnych linii, które szczegółowo scharakteryzowaliśmy, byliśmy w stanie przeanalizować wzory fluorescencji uzyskane za pomocą konstruktu pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (ryc. uzupełniająca 8g–j, l). W tej linii kontrolnej wykryto jedynie niewielkie zmiany w stosunku fluorescencji w SAM, ale w centrum SAM zaobserwowaliśmy wyraźny i nieoczekiwany spadek VENUS związany z TagBFP. Potwierdza to, że wzorzec sygnalizacji obserwowany przez qmRGA odzwierciedla zależną od GA degradację mRGA-VENUS, ale również dowodzi, że qmRGA może przeceniać aktywność sygnalizacji GA w centrum merystemu. Podsumowując, nasze wyniki ujawniają wzorzec sygnalizacji GA, który odzwierciedla przede wszystkim rozmieszczenie zawiązków. Ten rozkład regionu międzyzawiązkowego (IPR) wynika ze stopniowego ustalania wysokiej aktywności sygnalizacji GA między rozwijającym się zawiązkiem a regionem centralnym, podczas gdy jednocześnie aktywność sygnalizacji GA w zawiązku spada (ryc. 4c, d).
Rozkład receptorów GID1b i GID1c (patrz powyżej) sugeruje, że różnicowa ekspresja receptorów GA pomaga kształtować wzorzec aktywności sygnalizacyjnej GA w SAM. Zastanawialiśmy się, czy może być w to zaangażowana zróżnicowana akumulacja GA. Aby zbadać tę możliwość, wykorzystaliśmy czujnik FRET GA nlsGPS121. Zwiększoną częstotliwość aktywacji wykryto w SAM nlsGPS1 traktowanego 10 μM GA4+7 przez 100 min (Rys. uzupełniający 9a–e), co wskazuje, że nlsGPS1 reaguje na zmiany stężenia GA w SAM, podobnie jak w korzeniach21. Przestrzenny rozkład częstotliwości aktywacji nlsGPS1 ujawnił stosunkowo niskie poziomy GA w zewnętrznych warstwach SAM, ale wykazał, że były one podwyższone w centrum i na granicach SAM (Rys. 4e i Rys. uzupełniający 9a,c). Sugeruje to, że GA jest również rozłożony w SAM z przestrzennym wzorem porównywalnym do tego ujawnionego przez qmRGA. Jako podejście uzupełniające, poddaliśmy SAM również działaniu fluorescencyjnego GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) lub samego Fl jako kontroli negatywnej. Sygnał Fl był rozłożony w całej SAM, w tym w regionie centralnym i zawiązku, aczkolwiek z niższą intensywnością (Rys. 4j i Rys. uzupełniający 10d). Natomiast wszystkie trzy GA-Fl gromadziły się specyficznie w granicach zawiązku i w różnym stopniu w pozostałej części IPR, przy czym GA7-Fl gromadził się w największej domenie w IPR (Rys. 4k i Rys. uzupełniający 10a,b). Kwantyfikacja intensywności fluorescencji wykazała, że stosunek intensywności IPR do nie-IPR był wyższy w SAM leczonym GA-Fl w porównaniu z SAM leczonym Fl (Rys. 4l i Rys. uzupełniający 10c). Łącznie, wyniki te sugerują, że GA występuje w wyższych stężeniach w komórkach IPR zlokalizowanych najbliżej granic narządów. Sugeruje to, że wzorzec aktywności sygnalizacyjnej GA w SAM wynika zarówno z zróżnicowanej ekspresji receptorów GA, jak i zróżnicowanej akumulacji GA w komórkach IPR w pobliżu granic narządów. Zatem nasza analiza ujawniła nieoczekiwany przestrzenno-czasowy wzorzec sygnalizacji GA, z niższą aktywnością w centrum i zawiązku SAM oraz wyższą aktywnością w IPR w regionie obwodowym.
Aby zrozumieć rolę zróżnicowanej aktywności sygnalizacyjnej GA w SAM, przeanalizowaliśmy korelację między aktywnością sygnalizacyjną GA, ekspansją komórek i podziałem komórek, wykorzystując obrazowanie poklatkowe w czasie rzeczywistym SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Biorąc pod uwagę rolę GA w regulacji wzrostu, oczekiwano dodatniej korelacji z parametrami ekspansji komórek. Dlatego najpierw porównaliśmy mapy aktywności sygnalizacyjnej GA z mapami tempa wzrostu na powierzchni komórek (jako przybliżenie siły ekspansji komórek dla danej komórki i komórek potomnych w momencie podziału) oraz z mapami anizotropii wzrostu, które mierzą kierunkowość ekspansji komórek (również stosowane tutaj dla danej komórki i komórek potomnych w momencie podziału; rys. 5a, b, patrz Metody i Metody Uzupełniające). Nasze mapy tempa wzrostu na powierzchni komórek SAM są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami38,39, z minimalnymi tempami wzrostu na granicy i maksymalnymi tempami wzrostu w rozwijających się kwiatach (rys. 5a). Analiza głównych składowych (PCA) wykazała, że aktywność sygnalizacyjna GA była ujemnie skorelowana z intensywnością wzrostu powierzchni komórek (ryc. 5c). Wykazaliśmy również, że główne osie zmienności, w tym sygnał wejściowy GA i intensywność wzrostu, były ortogonalne do kierunku wyznaczonego przez wysoką ekspresję CLV3, co potwierdza wykluczenie komórek z centrum SAM w pozostałych analizach. Analiza korelacji Spearmana potwierdziła wyniki PCA (ryc. 5d), wskazując, że wyższe sygnały GA w IPR nie skutkowały większą ekspansją komórek. Jednakże analiza korelacji ujawniła niewielką dodatnią korelację między aktywnością sygnalizacyjną GA a anizotropią wzrostu (ryc. 5c, d), co sugeruje, że wyższa sygnalizacja GA w IPR wpływa na kierunek wzrostu komórek i prawdopodobnie na położenie płaszczyzny podziału komórkowego.
a, b Mapy cieplne średniego wzrostu powierzchni (a) i anizotropii wzrostu (b) w SAM uśrednione dla siedmiu niezależnych roślin (używane jako wskaźniki siły i kierunku ekspansji komórek, odpowiednio). c Analiza PCA obejmowała następujące zmienne: sygnał GA, intensywność wzrostu powierzchni, anizotropię wzrostu powierzchni i ekspresję CLV3. Składnik PCA 1 był głównie negatywnie skorelowany z intensywnością wzrostu powierzchni i pozytywnie skorelowany z sygnałem GA. Składnik PCA 2 był głównie pozytywnie skorelowany z anizotropią wzrostu powierzchni i negatywnie skorelowany z ekspresją CLV3. Procenty przedstawiają zmienność wyjaśnioną przez każdy składnik. d Analiza korelacji Spearmana między sygnałem GA, intensywnością wzrostu powierzchni i anizotropią wzrostu powierzchni w skali tkanki z wyłączeniem CZ. Liczba po prawej stronie to wartość rho Spearmana między dwiema zmiennymi. Gwiazdki oznaczają przypadki, w których korelacja/ujemna korelacja jest wysoce istotna. e Wizualizacja 3D komórek Col-0 SAM L1 za pomocą mikroskopii konfokalnej. Nowe ściany komórkowe utworzone w SAM (ale nie zawiązek) po 10 h są pokolorowane zgodnie z ich wartościami kątowymi. Pasek kolorów pokazano w prawym dolnym rogu. Wstawka pokazuje odpowiadający obraz 3D po 0 h. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami. f Wykresy pudełkowe przedstawiają wskaźniki podziałów komórkowych w IPR i nie-IPR Col-0 SAM (n = 10 niezależnych roślin). Linia środkowa pokazuje medianę, a granice pola wskazują 25. i 75. percentyl. Wąsy wskazują wartości minimalne i maksymalne określone za pomocą oprogramowania R. Wartości p uzyskano za pomocą dwustronnego testu t Welcha. g, h Schematyczny diagram pokazujący (g) jak mierzyć kąt nowej ściany komórkowej (magenta) względem kierunku promieniowego od środka SAM (biała linia przerywana) (rozważane są tylko wartości kątów ostrych, tj. 0–90°) oraz (h) kierunki obwodowy/boczny i promieniowy w merystemie. i Histogramy częstości orientacji płaszczyzny podziału komórek w warstwie SAM (ciemnoniebieski), IPR (średnioniebieski) i non-IPR (jasnoniebieski). Wartości p uzyskano za pomocą dwustronnego testu Kołmogorowa-Smirnowa. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami. j Histogramy częstości orientacji płaszczyzny podziału komórek w warstwie IPR wokół P3 (jasnozielony), P4 (średniozielony) i P5 (ciemnozielony). Wartości p uzyskano za pomocą dwustronnego testu Kołmogorowa-Smirnowa. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami.
Dlatego też, w dalszej kolejności zbadaliśmy korelację między sygnalizacją GA a aktywnością podziałową komórek, identyfikując nowo utworzone ściany komórkowe podczas testu (ryc. 5e). To podejście pozwoliło nam zmierzyć częstotliwość i kierunek podziałów komórkowych. Ku naszemu zaskoczeniu, odkryliśmy, że częstotliwość podziałów komórkowych w komórkach IPR i pozostałych komórkach SAM (nie-IPR, ryc. 5f) była podobna, co wskazuje, że różnice w sygnalizacji GA między komórkami IPR i nie-IPR nie wpływają znacząco na podział komórek. To, a także dodatnia korelacja między sygnalizacją GA a anizotropią wzrostu, skłoniły nas do rozważenia, czy aktywność sygnalizacji GA może wpływać na orientację płaszczyzny podziału komórkowego. Zmierzyliśmy orientację nowej ściany komórkowej jako kąt ostry względem osi promieniowej łączącej środek merystemu ze środkiem nowej ściany komórkowej (ryc. 5e-i) i zaobserwowaliśmy wyraźną tendencję komórek do podziału pod kątem bliskim 90° względem osi promieniowej, z najwyższą częstością obserwowaną dla 70–80° (23,28%) i 80–90° (22,62%) (ryc. 5e,i), co odpowiada podziałom komórek w kierunku obwodowym/poprzecznym (ryc. 5h). Aby zbadać wpływ sygnalizacji GA na ten proces podziału komórek, przeanalizowaliśmy parametry podziału komórek oddzielnie w IPR i non-IPR (ryc. 5i). Zaobserwowaliśmy, że rozkład kątów podziału w komórkach IPR różnił się od rozkładu w komórkach nie-IPR lub w komórkach w całym SAM, przy czym komórki IPR wykazywały wyższy odsetek podziałów bocznych/kołowych, tj. 70–80° i 80–90° (odpowiednio 33,86% i 30,71%, odpowiadające proporcje) (Rys. 5i). Zatem nasze obserwacje ujawniły związek między wysokim sygnałem GA a orientacją płaszczyzny podziału komórki bliską kierunkowi obwodowemu, podobnie do korelacji między aktywnością sygnałową GA a anizotropią wzrostu (Rys. 5c, d). Aby dodatkowo ustalić zachowanie przestrzenne tego związku, zmierzyliśmy orientację płaszczyzny podziału w komórkach IPR otaczających zawiązek, zaczynając od P3, ponieważ najwyższą aktywność sygnałową GA wykryto w tym regionie, zaczynając od P4 (Rys. 4). Kąty podziału IPR w okolicach P3 i P4 nie wykazały statystycznie istotnych różnic, chociaż zaobserwowano zwiększoną częstość podziałów bocznych komórek w IPR w okolicach P4 (ryc. 5j). Jednak w komórkach IPR w okolicach P5 różnica w orientacji płaszczyzny podziału stała się statystycznie istotna, z gwałtownym wzrostem częstości podziałów poprzecznych (ryc. 5j). Łącznie te wyniki sugerują, że sygnalizacja GA może kontrolować orientację podziałów komórkowych w SAM, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami40,41, że wysoka sygnalizacja GA może indukować boczną orientację podziałów komórkowych w IPR.
Przewiduje się, że komórki w IPR nie zostaną włączone do zawiązków, lecz do międzywęźli2,42,43. Poprzeczna orientacja podziałów komórkowych w IPR może skutkować typową organizacją równoległych, podłużnych rzędów komórek epidermy w międzywęźlach. Nasze obserwacje opisane powyżej sugerują, że sygnalizacja GA prawdopodobnie odgrywa rolę w tym procesie, regulując kierunek podziału komórek.
Utrata funkcji kilku genów DELLA prowadzi do konstytutywnej odpowiedzi GA, a mutanty della mogą być użyte do przetestowania tej hipotezy44. Najpierw przeanalizowaliśmy wzorce ekspresji pięciu genów DELLA w SAM. Fuzja transkrypcyjna linii GUS45 wykazała, że GAI, RGA, RGL1 i RGL2 (w znacznie mniejszym stopniu) były ekspresjonowane w SAM (Rys. uzupełniający 11a–d). Hybrydyzacja in situ wykazała ponadto, że mRNA GAI kumuluje się specyficznie w zawiązkach i rozwijających się kwiatach (Rys. uzupełniający 11e). MRNA RGL1 i RGL3 wykryto w całej koronie SAM i w starszych kwiatach, natomiast mRNA RGL2 było bardziej obfite w regionie granicznym (Rys. uzupełniający 11f–h). Obrazowanie konfokalne pRGL3::RGL3-GFP SAM potwierdziło ekspresję obserwowaną w hybrydyzacji in situ i wykazało, że białko RGL3 kumuluje się w centralnej części SAM (Rys. uzupełniający 11i). Używając linii pRGA::GFP-RGA, zaobserwowaliśmy również, że białko RGA kumuluje się w SAM, ale jego ilość maleje na granicy, począwszy od P4 (Rys. uzupełniający 11j). Co istotne, wzorce ekspresji RGL3 i RGA są zgodne z wyższą aktywnością sygnalizacyjną GA w IPR, co wykryto metodą qmRGA (Rys. 4). Ponadto dane te wskazują, że wszystkie białka DELLA są ekspresjonowane w SAM i że ich łączna ekspresja obejmuje cały SAM.
Następnie przeanalizowaliśmy parametry podziału komórek w dzikim typie SAM (Ler, kontrola) i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globalne) mutanty (rys. 6a, b). Co ciekawe, zaobserwowaliśmy statystycznie istotną zmianę w rozkładzie częstości kątów podziału komórek w globalnym mutancie della SAM w porównaniu z typem dzikim (rys. 6c). Ta zmiana w globalnym mutancie della była spowodowana wzrostem częstości kątów 80–90° (34,71% w porównaniu z 24,55%) i, w mniejszym stopniu, kątów 70–80° (23,78% w porównaniu z 20,18%), tj. odpowiadających poprzecznym podziałom komórek (rys. 6c). Częstotliwość podziałów niepoprzecznych (0–60°) była również niższa w globalnym mutancie della (rys. 6c). Częstotliwość poprzecznych podziałów komórkowych była istotnie zwiększona w SAM mutanta della global (ryc. 6b). Częstotliwość poprzecznych podziałów komórkowych w IPR była również wyższa w mutancie della global w porównaniu z typem dzikim (ryc. 6d). Poza regionem IPR, typ dziki charakteryzował się bardziej równomiernym rozkładem kątów podziałów komórkowych, podczas gdy mutant della global preferował podziały styczne, podobnie jak IPR (ryc. 6e). Określiliśmy również ilościowo orientację podziałów komórkowych w SAM pięciokrotnych mutantów oksydazy ga2 (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 i ga2ox6-2), czyli nieaktywnego pod względem GA tła mutanta, w którym GA się kumuluje. Zgodnie ze wzrostem poziomu GA, SAM kwiatostanu z pięciokrotnym mutantem ga2ox był większy niż w przypadku Col-0 (rys. uzupełniający 12a, b). W porównaniu z Col-0, SAM z pięciokrotnym mutantem ga2ox charakteryzował się wyraźnie innym rozkładem kątów podziału komórek, przy czym częstość kątów wzrosła z 50° do 90°, co ponownie sprzyjało podziałom stycznym (rys. uzupełniający 12a–c). Zatem wykazujemy, że konstytutywna aktywacja sygnalizacji GA i akumulacja GA indukują boczne podziały komórek w IPR i pozostałej części SAM.
a, b Wizualizacja 3D warstwy L1 barwionej PI Ler (a) i globalnego mutanta della (b) SAM przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Nowe ściany komórkowe utworzone w SAM (ale nie zawiązek) w okresie 10 godzin są pokazane i pokolorowane zgodnie z ich wartościami kątowymi. Wstawka przedstawia SAM w godzinie 0. Pasek kolorów jest wyświetlany w prawym dolnym rogu. Strzałka w (b) wskazuje przykład wyrównanych plików komórek w globalnym mutancie della. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami. Porównanie rozkładu częstości orientacji płaszczyzny podziału komórek w całej SAM (d), IPR (e) i non-IPR (f) między Ler a globalnym della. Wartości p uzyskano za pomocą dwustronnego testu Kołmogorowa-Smirnowa. f, g Wizualizacja 3D obrazów konfokalnych barwionej PI SAM roślin transgenicznych Col-0 (i) i pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panele (a, b) przedstawiają nowe ściany komórkowe (ale nie zawiązki) utworzone w SAM w ciągu 10 godzin. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z podobnymi wynikami. h–j Porównanie rozkładu częstości orientacji płaszczyzny podziału komórkowego w całej SAM (h), IPR (i) i non-IPR (j) między roślinami Col-0 i pCUC2::gai-1-VENUS. Wartości p uzyskano za pomocą dwustronnego testu Kołmogorowa–Smirnowa.
Następnie przetestowaliśmy efekt hamowania sygnalizacji GA specyficznie w IPR. W tym celu wykorzystaliśmy promotor liścienia cup 2 (CUC2) do stymulacji ekspresji dominującego negatywnego białka gai-1 połączonego z VENUS (w linii pCUC2::gai-1-VENUS). W dzikim typie SAM promotor CUC2 stymuluje ekspresję większości IPR w SAM, w tym komórek granicznych, od P4, a podobną specyficzną ekspresję zaobserwowano w roślinach pCUC2::gai-1-VENUS (patrz poniżej). Rozkład kątów podziału komórek w SAM lub IPR roślin pCUC2::gai-1-VENUS nie różnił się istotnie od tego w typie dzikim, chociaż nieoczekiwanie odkryliśmy, że komórki bez IPR w tych roślinach dzieliły się z wyższą częstością, wynoszącą 80–90° (ryc. 6f–j).
Sugerowano, że kierunek podziału komórek zależy od geometrii SAM, w szczególności od naprężeń rozciągających generowanych przez krzywiznę tkanki46. W związku z tym zadaliśmy pytanie, czy kształt SAM uległ zmianie w mutancie della global i roślinach pCUC2::gai-1-VENUS. Jak wcześniej informowano12, rozmiar mutanta della global SAM był większy niż w przypadku typu dzikiego (Rys. uzupełniający 13a, b, d). Hybrydyzacja in situ CLV3 i STM RNA potwierdziła ekspansję merystemu u mutantów della i dodatkowo wykazała boczną ekspansję niszy komórek macierzystych (Rys. uzupełniający 13e, f, h, i). Jednakże krzywizna SAM była podobna w obu genotypach (Rys. uzupełniający 13k, m, n, p). Zaobserwowaliśmy podobny wzrost wielkości u mutanta gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple bez zmiany krzywizny w porównaniu z typem dzikim (Rys. uzupełniająca 13c, d, g, j, l, o, p). Częstotliwość podziału komórek była również zmieniona u mutanta della quadruple, ale w mniejszym stopniu niż u mutanta della monolitycznego (Rys. uzupełniająca 12d–f). Ten efekt dawkowania, wraz z brakiem wpływu na krzywiznę, sugeruje, że resztkowa aktywność RGL3 w mutancie Della quadruple ogranicza zmiany orientacji podziału komórek spowodowane utratą aktywności DELLA i że zmiany w bocznych podziałach komórek zachodzą w odpowiedzi na zmiany aktywności sygnalizacyjnej GA, a nie na zmiany geometrii SAM. Jak opisano powyżej, promotor CUC2 napędza ekspresję IPR w SAM począwszy od P4 (Rys. uzupełniająca 14a, b), natomiast komórka pCUC2::gai-1-VENUS SAM charakteryzowała się mniejszym rozmiarem, ale większą krzywizną (Rys. uzupełniająca 14c–h). Ta zmiana w morfologii komórki pCUC2::gai-1-VENUS SAM może skutkować innym rozkładem naprężeń mechanicznych w porównaniu z typem dzikim, w którym wysokie naprężenia obwodowe rozpoczynają się w mniejszej odległości od środka komórki SAM47. Alternatywnie, zmiany w morfologii komórki pCUC2::gai-1-VENUS SAM mogą wynikać ze zmian regionalnych właściwości mechanicznych indukowanych przez ekspresję transgenu48. W obu przypadkach może to częściowo zniwelować wpływ zmian w sygnalizacji GA poprzez zwiększenie prawdopodobieństwa, że komórki będą się dzielić w orientacji obwodowej/poprzecznej, co wyjaśnia nasze obserwacje.
Podsumowując, nasze dane potwierdzają, że wyższy poziom sygnalizacji GA odgrywa aktywną rolę w bocznej orientacji płaszczyzny podziału komórki w IPR. Pokazują one również, że krzywizna merystemu również wpływa na orientację płaszczyzny podziału komórki w IPR.
Poprzeczna orientacja płaszczyzny podziału w IPR, wynikająca z wysokiej aktywności sygnalizacyjnej GA, sugeruje, że GA wstępnie organizuje promienisty zbiór komórek w naskórku w obrębie SAM, definiując organizację komórkową, która później będzie widoczna w międzywęźle naskórkowym. Rzeczywiście, takie zbiory komórek były często widoczne na obrazach SAM mutantów della global (ryc. 6b). Dlatego, aby dokładniej zbadać funkcję rozwojową przestrzennego wzorca sygnalizacji GA w SAM, wykorzystaliśmy obrazowanie poklatkowe do analizy organizacji przestrzennej komórek w IPR u roślin dzikiego typu (Ler i Col-0), mutantów della global oraz roślin transgenicznych pCUC2::gai-1-VENUS.
Odkryliśmy, że qmRGA wykazało, że aktywność sygnalizacji GA w IPR wzrastała od P1/P2 i osiągała szczyt w P4, a ten wzór pozostawał stały w czasie (Rys. 4a–f i Rys. uzupełniający 8c–f, k). Aby przeanalizować organizację przestrzenną komórek w IPR ze wzrastającym sygnałem GA, oznaczyliśmy komórki Ler IPR powyżej i po bokach P4 zgodnie z ich losem rozwojowym analizowanym 34 godziny po pierwszej obserwacji, tj. więcej niż dwa razy plastydowe, co pozwoliło nam śledzić komórki IPR podczas rozwoju zawiązku od P1/P2 do P4. Użyliśmy trzech różnych kolorów: żółtego dla tych komórek, które zostały zintegrowane z zawiązkiem w pobliżu P4, zielonego dla tych, które znajdowały się w IPR i fioletowego dla tych, które uczestniczyły w obu procesach (Rys. 7a–c). W t0 (0 h) widoczne były 1–2 warstwy komórek IPR przed P4 (Rys. 7a). Zgodnie z oczekiwaniami, podział tych komórek odbywał się głównie poprzez płaszczyznę podziału poprzecznego (ryc. 7a–c). Podobne wyniki uzyskano stosując Col-0 SAM (skupiając się na P3, którego granica fałduje się podobnie jak P4 w Ler), chociaż w tym genotypie fałd utworzony na granicy kwiatowej szybciej ukrywał komórki IPR (ryc. 7g–i). Zatem wzór podziału komórek IPR preorganizuje je w rzędy promieniste, podobnie jak w międzywęźlach. Organizacja rzędów promienistych i lokalizacja komórek IPR pomiędzy kolejnymi narządami sugerują, że komórki te są progenitorami międzywęzłowymi.
W niniejszym badaniu opracowaliśmy ratiometryczny biosensor sygnalizacji GA, qmRGA, który umożliwia ilościowe mapowanie aktywności sygnalizacji GA wynikającej z połączonych stężeń GA i receptora GA, minimalizując jednocześnie interferencję z endogennymi szlakami sygnałowymi, dostarczając w ten sposób informacji o funkcji GA na poziomie komórkowym. W tym celu skonstruowaliśmy zmodyfikowane białko DELLA, mRGA, które utraciło zdolność wiązania partnerów interakcji DELLA, ale pozostaje wrażliwe na proteolizę indukowaną przez GA. qmRGA reaguje zarówno na egzogenne, jak i endogenne zmiany poziomów GA, a jego dynamiczne właściwości sensoryczne umożliwiają ocenę czasoprzestrzennych zmian aktywności sygnalizacji GA w trakcie rozwoju. qmRGA jest również bardzo elastycznym narzędziem, ponieważ można je dostosować do różnych tkanek poprzez zmianę promotora używanego do jego ekspresji (w razie potrzeby). Biorąc pod uwagę konserwatywny charakter szlaku sygnalizacji GA i motywu PFYRE u okrytonasiennych, jest prawdopodobne, że będzie można je przenieść na inne gatunki22. Zgodnie z tym, wykazano, że równoważna mutacja w białku DELLA SLR1 ryżu (HYY497AAA) również hamuje aktywność represora wzrostu SLR1, jednocześnie nieznacznie zmniejszając jego degradację zależną od GA, podobnie jak w przypadku mRGA23. Co ciekawe, ostatnie badania na Arabidopsis wykazały, że pojedyncza mutacja aminokwasowa w domenie PFYRE (S474L) zmieniała aktywność transkrypcyjną RGA bez wpływu na jego zdolność do interakcji z partnerami czynników transkrypcyjnych50. Chociaż mutacja ta jest bardzo zbliżona do 3 substytucji aminokwasowych obecnych w mRGA, nasze badania pokazują, że te dwie mutacje zmieniają odrębne cechy DELLA. Chociaż większość partnerów czynników transkrypcyjnych wiąże się z domenami LHR1 i SAW białka DELLA26,51, niektóre konserwatywne aminokwasy w domenie PFYRE mogą pomóc w stabilizacji tych interakcji.
Rozwój międzywęźli jest kluczową cechą w architekturze roślin i poprawie plonów. qmRGA ujawniło wyższą aktywność sygnalizacyjną GA w komórkach progenitorowych międzywęźli IPR. Łącząc obrazowanie ilościowe z genetyką, wykazaliśmy, że wzorce sygnalizacji GA nakładają się na koliste/poprzeczne płaszczyzny podziału komórek w epidermie SAM, kształtując organizację podziału komórek niezbędną do rozwoju międzywęźli. W trakcie rozwoju zidentyfikowano kilka regulatorów orientacji płaszczyzny podziału komórek52,53. Nasza praca stanowi wyraźny przykład tego, jak aktywność sygnalizacji GA reguluje ten parametr komórkowy. DELLA może oddziaływać z kompleksami białek prefoldujących41, zatem sygnalizacja GA może regulować orientację płaszczyzny podziału komórek poprzez bezpośredni wpływ na orientację mikrotubul korowych40,41,54,55. Nieoczekiwanie wykazaliśmy, że w SAM korelatem wyższej aktywności sygnalizacji GA nie było wydłużanie ani podział komórek, a jedynie anizotropia wzrostu, co jest zgodne z bezpośrednim wpływem GA na kierunek podziału komórek w IPR. Nie możemy jednak wykluczyć, że efekt ten może być również pośredni, na przykład za pośrednictwem zmiękczenia ścian komórkowych indukowanego przez GA56. Zmiany właściwości ścian komórkowych wywołują naprężenia mechaniczne57,58, które mogą również wpływać na orientację płaszczyzny podziału komórkowego poprzez wpływ na orientację mikrotubul korowych39,46,59. Połączone efekty naprężeń mechanicznych indukowanych przez GA i bezpośredniej regulacji orientacji mikrotubul przez GA mogą być zaangażowane w generowanie specyficznego wzorca orientacji podziałów komórkowych w IPR w celu zdefiniowania międzywęźli, a dalsze badania są potrzebne, aby zweryfikować tę hipotezę. Podobnie, wcześniejsze badania podkreśliły znaczenie białek TCP14 i 15 oddziałujących z DELLA w kontroli formowania międzywęźli60,61, a czynniki te mogą pośredniczyć w działaniu GA wraz z BREVIPEDICELLUS (BP) i PENNYWISE (PNY), które regulują rozwój międzywęźli i wykazano, że wpływają na sygnalizację GA2,62. Biorąc pod uwagę, że DELLA oddziałują ze szlakami sygnałowymi brassinosteroidów, etylenu, kwasu jasmonowego i kwasu abscysynowego (ABA)63,64 i że hormony te mogą wpływać na orientację mikrotubul65, wpływ GA na orientację podziału komórek może być również pośredniczony przez inne hormony.
Wczesne badania cytologiczne wykazały, że zarówno wewnętrzna, jak i zewnętrzna część tkanki SAM Arabidopsis są niezbędne do rozwoju międzywęźli2,42. Fakt, że GA aktywnie reguluje podział komórek w tkankach wewnętrznych12, potwierdza podwójną funkcję GA w regulacji merystemu i wielkości międzywęźli w tkance SAM. Wzór kierunkowego podziału komórek jest również ściśle regulowany w wewnętrznej tkance SAM, a regulacja ta jest niezbędna do wzrostu łodygi52. Interesujące będzie zbadanie, czy GA odgrywa również rolę w orientacji płaszczyzny podziału komórek w wewnętrznej strukturze SAM, synchronizując w ten sposób specyfikację i rozwój międzywęźli w obrębie SAM.
Rośliny hodowano in vitro w glebie lub podłożu 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) uzupełnionym 1% sacharozą i 1% agarem (Sigma) w standardowych warunkach (16 h światła, 22°C), z wyjątkiem eksperymentów z hipokotylem i wzrostem korzeni, w których siewki hodowano na pionowych płytkach w stałym świetle i temperaturze 22°C. W eksperymentach z azotanami rośliny hodowano na zmodyfikowanym podłożu MS (bioWORLD plant medium) uzupełnionym odpowiednią ilością azotanów (0 lub 10 mM KNO3), 0,5 mM bursztynianu NH4, 1% sacharozy i 1% agaru A (Sigma) w warunkach dnia długiego.
cDNA GID1a wstawione do pDONR221 zostało zrekombinowane z pDONR P4-P1R-pUBQ10 i pDONR P2R-P3-mCherry do pB7m34GW w celu wygenerowania pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 wstawione do pDONR221 zostało zrekombinowane do pB7RWG266 w celu wygenerowania p35S:IDD2-RFP. Aby wygenerować pGID1b::2xmTQ2-GID1b, najpierw amplifikowano fragment o wielkości 3,9 kb położony powyżej regionu kodującego GID1b oraz fragment o wielkości 4,7 kb zawierający cDNA GID1b (1,3 kb) i terminator (3,4 kb) przy użyciu starterów z Tabeli uzupełniającej 3, a następnie wstawiono odpowiednio do pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) i pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), a na koniec zrekombinowano z pDONR221 2xmTQ268 do wektora docelowego pGreen 012567 przy użyciu klonowania Gateway. Aby wygenerować pCUC2::LSSmOrange, sekwencję promotora CUC2 (3229 pb przed ATG), a następnie sekwencję kodującą dużego przesuniętego Stokesa mOrange (LSSmOrange)69 z sygnałem lokalizacji jądrowej N7 i terminatorem transkrypcji NOS, zmontowano w wektorze docelowym kanamycyny pGreen, wykorzystując system rekombinacji 3-fragmentów Gateway (Invitrogen). Roślinny wektor binarny wprowadzono do szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101 i do liści Nicotiana benthamiana metodą infiltracji Agrobacterium oraz do liści Arabidopsis thaliana Col-0 metodą zanurzania w kwiatach. Komórki pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry i pCLV3::mCherry-NLS qmRGA wyizolowano z potomstwa F3 i F1 z odpowiednich krzyżówek.
Hybrydyzację in situ RNA przeprowadzono na końcówkach pędów o długości około 1 cm72, które zebrano i natychmiast utrwalono w roztworze FAA (3,7% formaldehydu, 5% kwasu octowego, 50% etanolu) wstępnie schłodzonym do 4°C. Po 2 × 15 min inkubacji próżniowej wymieniono utrwalacz i próbki inkubowano przez noc. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 i RGL3 oraz sondy antysensowe do ich 3′-UTR zsyntetyzowano przy użyciu starterów przedstawionych w Tabeli Uzupełniającej 3, zgodnie z opisem Rosiera i in.73. Sondy znakowane digoksygeniną poddano immunodetekcji przy użyciu przeciwciał przeciwko digoksygeninie (rozcieńczenie 3000-krotne; Roche, numer katalogowy: 11 093 274 910), a skrawki barwiono roztworem 5-bromo-4-chloro-3-indolylofosforanu (BCIP, rozcieńczenie 250-krotne)/nitroblue tetrazolium (NBT, rozcieńczenie 200-krotne).
Czas publikacji: 10 lutego 2025 r.