Białka DELLA są konserwowaneregulatory wzrostuktóre odgrywają centralną rolę w rozwoju roślin w odpowiedzi na sygnały wewnętrzne i zewnętrzne. Jako regulatory transkrypcyjne, DELLA wiążą się z czynnikami transkrypcyjnymi (TF) i histonem H2A za pośrednictwem swoich domen GRAS i są rekrutowane do działania na promotory. Ostatnie badania wykazały, że stabilność DELLA jest regulowana potranslacyjnie przez dwa mechanizmy: poliubikwitynację indukowaną przez hormon roślinnygiberelina, co prowadzi do ich szybkiej degradacji i sprzężenia z małym modyfikatorem podobnym do ubikwityny (SUMO), co zwiększa ich akumulację. Co więcej, aktywność DELLA jest dynamicznie regulowana przez dwa odrębne mechanizmy glikozylacji: O-fukozylacja wzmacnia interakcję DELLA-TF, podczas gdy modyfikacja O-połączona N-acetyloglukozaminą (O-GlcNAc) hamuje interakcję DELLA-TF. Jednak rola fosforylacji DELLA jest niejasna, ponieważ poprzednie badania wykazały sprzeczne wyniki, przy czym niektóre sugerują, że fosforylacja promuje lub hamuje degradację DELLA, a inne sugerują, że fosforylacja nie wpływa na ich stabilność. Tutaj identyfikujemy miejsca fosforylacji w represorze GA1-3 (RGA), AtDELLA, oczyszczonym z Arabidopsis thaliana za pomocą spektrometrii masowej i pokazujemy, że fosforylacja dwóch peptydów RGA w regionach PolyS i PolyS/T zwiększa aktywność RGA poprzez promowanie wiązania H2A i asocjacji RGA z promotorami docelowymi. Co godne uwagi, fosforylacja nie wpłynęła na interakcje RGA-TF ani na stabilność RGA. Nasze badanie ujawnia mechanizm molekularny, za pomocą którego fosforylacja indukuje aktywność DELLA.
Nasza analiza spektrometrii masowej wykazała, że zarówno Pep1, jak i Pep2 były silnie fosforylowane w RGA na tle Ga1 z niedoborem GA. Oprócz tego badania, badania fosfoproteomiczne ujawniły również fosforylację Pep1 w RGA, chociaż jej rola nie została jeszcze zbadana53,54,55. Natomiast fosforylacja Pep2 nie została wcześniej opisana, ponieważ peptyd ten można było wykryć tylko przy użyciu transgenu RGAGKG. Chociaż mutacja m1A, która zniosła fosforylację Pep1, tylko nieznacznie zmniejszyła aktywność RGA in planta, miała ona efekt addytywny w połączeniu z m2A w zmniejszaniu aktywności RGA (Rysunek uzupełniający 6). Co ważne, fosforylacja Pep1 była znacząco zmniejszona w mutancie sly1 z ulepszonym GA w porównaniu z ga1, co sugeruje, że GA promuje defosforylację RGA, zmniejszając jego aktywność. Mechanizm, za pomocą którego GA tłumi fosforylację RGA, wymaga dalszych badań. Jedną z możliwości jest to, że osiąga się to poprzez regulację niezidentyfikowanej kinazy białkowej. Chociaż badania wykazały, że ekspresja kinazy białkowej CK1 EL1 jest zmniejszana przez GA w ryżu41, nasze wyniki wskazują, że mutacje wyższego rzędu homologu EL1 Arabidopsis (AEL1-4) nie zmniejszają fosforylacji RGA. Zgodnie z naszymi wynikami, niedawne badanie fosfoproteomiczne z wykorzystaniem linii nadmiernie ekspresujących AEL Arabidopsis i potrójnego mutanta ael nie zidentyfikowało żadnych białek DELLA jako substratów tych kinaz56. Kiedy przygotowywaliśmy manuskrypt, doniesiono, że GSK3, gen kodujący kinazę podobną do GSK3/SHAGGY w pszenicy (Triticum aestivum), może fosforylować DELLA (Rht-B1b)57, chociaż fosforylacja Rht-B1b przez GSK3 nie została potwierdzona w roślinach. Reakcje enzymatyczne in vitro w obecności GSK3, a następnie analiza spektrometrii masowej ujawniły trzy miejsca fosforylacji zlokalizowane pomiędzy domenami DELLA i GRAS Rht-B1b (Rys. uzupełniający 3). Podstawienia seryny na alaninę we wszystkich trzech miejscach fosforylacji skutkowały zmniejszeniem aktywności Rht-B1b w pszenicy transgenicznej, co jest zgodne z naszymi ustaleniami, że podstawienia alaniny w Pep2 RGA zmniejszyły aktywność RGA. Jednak badania degradacji białek in vitro wykazały dodatkowo, że fosforylacja może również stabilizować Rht-B1b57. Jest to w sprzeczności z naszymi wynikami pokazującymi, że podstawienia alaniny w Pep2 RGA nie zmieniają jego stabilności w roślinie. GSK3 w pszenicy jest ortologiem białka 2 niewrażliwego na brassinosteroidy (BIN2) w Arabidopsis 57. BIN2 jest negatywnym regulatorem sygnalizacji BR, a BR aktywuje jej szlak sygnałowy, powodując degradację BIN2 58. Wykazaliśmy, że leczenie BR nie zmniejsza stabilności RGA 59 ani poziomu fosforylacji w Arabidopsis (Rysunek uzupełniający 2), co sugeruje, że mało prawdopodobne jest, aby RGA był fosforylowany przez BIN2.
Wszystkie dane ilościowe zostały poddane analizie statystycznej przy użyciu programu Excel, a istotne różnice określono przy użyciu testu t-Studenta. Nie zastosowano żadnych metod statystycznych do wstępnego określenia wielkości próby. Żadne dane nie zostały wyłączone z analizy; eksperyment nie był randomizowany; a badacze byli świadomi alokacji podczas eksperymentu i oceny wyników. Wielkości próby podano w legendach rysunków i w plikach danych surowych.
Czas publikacji: 15-kwi-2025