Białka DELLA są konserwowaneregulatory wzrostuktóre odgrywają kluczową rolę w rozwoju roślin w odpowiedzi na sygnały wewnętrzne i zewnętrzne. Jako regulatory transkrypcji, DELLA wiążą się z czynnikami transkrypcyjnymi (TF) i histonem H2A poprzez swoje domeny GRAS i są rekrutowane do działania na promotory. Najnowsze badania wykazały, że stabilność DELLA jest regulowana potranslacyjnie przez dwa mechanizmy: poliubikwitynację indukowaną przez hormon roślinny.giberelina, co prowadzi do ich szybkiej degradacji i sprzężenia z małym modyfikatorem ubikwityny (SUMO), co zwiększa ich akumulację. Co więcej, aktywność DELLA jest dynamicznie regulowana przez dwa odrębne mechanizmy glikozylacji: O-fukozylacja wzmacnia interakcję DELLA-TF, podczas gdy modyfikacja O-połączoną N-acetyloglukozaminą (O-GlcNAc) hamuje interakcję DELLA-TF. Jednak rola fosforylacji DELLA jest niejasna, ponieważ wcześniejsze badania wykazały sprzeczne wyniki, z których niektóre sugerują, że fosforylacja promuje lub hamuje degradację DELLA, a inne sugerują, że fosforylacja nie wpływa na ich stabilność. W niniejszym artykule identyfikujemy miejsca fosforylacji w represorze GA1-3 (RGA), AtDELLA, oczyszczonym z Arabidopsis thaliana metodą spektrometrii masowej i wykazujemy, że fosforylacja dwóch peptydów RGA w regionach PolyS i PolyS/T wzmacnia aktywność RGA poprzez promowanie wiązania H2A i asocjacji RGA z promotorami docelowymi. Co istotne, fosforylacja nie wpływała na interakcje RGA-TF ani na stabilność RGA. Nasze badanie ujawnia mechanizm molekularny, poprzez który fosforylacja indukuje aktywność DELLA.
Nasza analiza spektrometryczna mas wykazała, że zarówno Pep1, jak i Pep2 były silnie fosforylowane w RGA na tle Ga1 z niedoborem GA. Oprócz tego badania, badania fosfoproteomiczne również ujawniły fosforylację Pep1 w RGA, chociaż jej rola nie została jeszcze zbadana53,54,55. Z kolei fosforylacja Pep2 nie została wcześniej opisana, ponieważ peptyd ten można było wykryć jedynie za pomocą transgenu RGAGKG. Chociaż mutacja m1A, która znosiła fosforylację Pep1, tylko nieznacznie zmniejszała aktywność RGA in planta, w połączeniu z m2A miała efekt addytywny w zmniejszaniu aktywności RGA (Rysunek uzupełniający 6). Co istotne, fosforylacja Pep1 była istotnie zmniejszona w mutancie sly1 z dodatkiem GA w porównaniu z ga1, co sugeruje, że GA promuje defosforylację RGA, zmniejszając jego aktywność. Mechanizm, poprzez który GA hamuje fosforylację RGA, wymaga dalszych badań. Jedną z możliwości jest to, że jest to osiągane poprzez regulację niezidentyfikowanej kinazy białkowej. Chociaż badania wykazały, że ekspresja kinazy białkowej CK1 EL1 jest obniżana przez GA w ryżu41, nasze wyniki wskazują, że mutacje wyższego rzędu homologu EL1 z Arabidopsis (AEL1-4) nie zmniejszają fosforylacji RGA. Zgodnie z naszymi wynikami, niedawne badanie fosfoproteomiczne z wykorzystaniem linii nadeksprymujących AEL z Arabidopsis i potrójnego mutanta ael nie zidentyfikowało żadnych białek DELLA jako substratów tych kinaz56. Podczas przygotowywania manuskryptu doniesiono, że GSK3, gen kodujący kinazę podobną do GSK3/SHAGGY w pszenicy (Triticum aestivum), może fosforylować DELLA (Rht-B1b)57, chociaż fosforylacja Rht-B1b przez GSK3 nie została potwierdzona u roślin. Reakcje enzymatyczne in vitro w obecności GSK3, a następnie analiza spektrometrią mas ujawniły trzy miejsca fosforylacji zlokalizowane pomiędzy domenami DELLA i GRAS białka Rht-B1b (Rys. uzupełniający 3). Substytucje seryny alaniną we wszystkich trzech miejscach fosforylacji skutkowały zmniejszeniem aktywności białka Rht-B1b w pszenicy transgenicznej, co jest zgodne z naszymi ustaleniami, że substytucje alaniny w białku Pep2 RGA zmniejszały aktywność białka RGA. Jednakże, testy degradacji białek in vitro wykazały dodatkowo, że fosforylacja może również stabilizować białko Rht-B1b57. Jest to sprzeczne z naszymi wynikami, które wskazują, że substytucje alaniny w białku Pep2 RGA nie wpływają na jego stabilność w roślinach. GSK3 w pszenicy jest ortologiem białka BIN2 (brasinosteroid-insensitive protein 2) u Arabidopsis 57. BIN2 jest negatywnym regulatorem sygnalizacji BR, a BR aktywuje jej szlak sygnałowy, powodując degradację BIN2 58. Wykazaliśmy, że leczenie BR nie zmniejsza stabilności RGA 59 ani poziomu fosforylacji u Arabidopsis (Rysunek uzupełniający 2), co sugeruje, że fosforylacja RGA przez BIN2 jest mało prawdopodobna.
Wszystkie dane ilościowe poddano analizie statystycznej za pomocą programu Excel, a istotne różnice określono za pomocą testu t-Studenta. Nie zastosowano żadnych metod statystycznych do wstępnego określenia liczebności próby. Żadne dane nie zostały wykluczone z analizy; eksperyment nie był randomizowany; a badacze byli świadomi alokacji podczas eksperymentu i oceny wyników. Liczebność próby podano w legendach rysunków oraz w plikach z surowymi danymi.
Czas publikacji: 15 kwietnia 2025 r.