W badaniu tym oceniono śmiertelność, subśmiertelność i toksyczność komercyjnychcypermetrynaformulacji dla kijanek bezogonowych. W teście ostrym testowano stężenia 100–800 μg/l przez 96 godzin. W teście przewlekłym testowano naturalnie występujące stężenia cypermetryny (1, 3, 6 i 20 μg/l) pod kątem śmiertelności, a następnie wykonywano badanie mikrojąder i nieprawidłowości jądrowych czerwonych krwinek przez 7 dni. LC50 komercyjnej formulacji cypermetryny dla kijanek wynosiło 273,41 μg L−1. W teście przewlekłym najwyższe stężenie (20 μg L−1) skutkowało śmiertelnością większą niż 50%, ponieważ zabijało połowę testowanych kijanek. Test mikrojąder wykazał istotne wyniki przy stężeniu 6 i 20 μg L−1 i wykryto kilka nieprawidłowości jądrowych, co wskazuje, że komercyjna formulacja cypermetryny ma potencjał genotoksyczny wobec P. gracilis. Cypermetryna jest wysoce ryzykowna dla tego gatunku, co wskazuje, że może powodować wiele problemów i wpływać na dynamikę tego ekosystemu w krótkim i długim okresie. Dlatego można wnioskować, że komercyjne formulacje cypermetryny mają toksyczne działanie na P. gracilis.
W związku z ciągłą ekspansją działalności rolniczej i intensywnym stosowaniemzwalczanie szkodnikówśrodki, zwierzęta wodne są często narażone na pestycydy1,2. Zanieczyszczenie zasobów wodnych w pobliżu pól uprawnych może mieć wpływ na rozwój i przeżycie organizmów niebędących przedmiotem zwalczania, takich jak płazy.
Płazy stają się coraz ważniejsze w ocenie matryc środowiskowych. Bezogonowe są uważane za dobre bioindykatory zanieczyszczeń środowiska ze względu na ich unikalne cechy, takie jak złożone cykle życia, szybkie tempo wzrostu larw, status troficzny, przepuszczalna skóra10,11, zależność od wody w celu reprodukcji12 i niechronione jaja11,13,14. Mała żaba wodna (Physalaemus gracilis), powszechnie znana jako żaba płacząca, okazała się gatunkiem bioindykatorowym zanieczyszczenia pestycydami4,5,6,7,15. Gatunek ten występuje w wodach stojących, obszarach chronionych lub obszarach o zróżnicowanym siedlisku w Argentynie, Urugwaju, Paragwaju i Brazylii1617 i jest uważany za stabilny zgodnie z klasyfikacją IUCN ze względu na szerokie rozmieszczenie i tolerancję różnych siedlisk18.
Zgłaszano subletalne skutki u płazów po narażeniu na cypermetrynę, w tym zmiany behawioralne, morfologiczne i biochemiczne u kijanek23,24,25, zmienioną śmiertelność i czas metamorfozy, zmiany enzymatyczne, zmniejszone powodzenie wylęgu24,25, nadpobudliwość26, zahamowanie aktywności cholinoesterazy27 i zmiany w wydajności pływania7,28. Jednak badania nad genotoksycznymi skutkami cypermetryny u płazów są ograniczone. Dlatego ważne jest, aby ocenić podatność gatunków bezogonowych na cypermetrynę.
Zanieczyszczenie środowiska wpływa na normalny wzrost i rozwój płazów, ale najpoważniejszym niekorzystnym skutkiem jest uszkodzenie genetyczne DNA spowodowane narażeniem na pestycydy13. Analiza morfologii komórek krwi jest ważnym bioindykatorem zanieczyszczenia i potencjalnej toksyczności substancji dla gatunków dzikich29. Test mikrojąderkowy jest jedną z najczęściej stosowanych metod określania genotoksyczności substancji chemicznych w środowisku30. Jest to szybka, skuteczna i niedroga metoda, która jest dobrym wskaźnikiem zanieczyszczenia chemicznego organizmów, takich jak płazy31,32 i może dostarczyć informacji na temat narażenia na zanieczyszczenia genotoksyczne33.
Celem badania była ocena toksycznego wpływu komercyjnych preparatów cypermetryny na małe kijanki wodne przy użyciu testu mikrojądrowego i oceny ryzyka ekologicznego.
Skumulowana śmiertelność (%) kijanek P. gracilis narażonych na różne stężenia komercyjnej cypermetryny w ostrej fazie badania.
Skumulowana śmiertelność (%) kijanek P. gracilis narażonych na różne stężenia komercyjnej cypermetryny w trakcie testu przewlekłego.
Obserwowana wysoka śmiertelność była wynikiem efektów genotoksycznych u płazów narażonych na różne stężenia cypermetryny (6 i 20 μg/l), o czym świadczy obecność mikrojąder (MN) i nieprawidłowości jądrowych w erytrocytach. Powstawanie MN wskazuje na błędy w mitozie i jest związane ze słabym wiązaniem chromosomów do mikrotubul, defektami w kompleksach białkowych odpowiedzialnych za wychwyt i transport chromosomów, błędami w segregacji chromosomów i błędami w naprawie uszkodzeń DNA38,39 i może być związane ze stresem oksydacyjnym wywołanym pestycydami40,41. Inne nieprawidłowości obserwowano przy wszystkich ocenianych stężeniach. Zwiększające się stężenia cypermetryny zwiększały nieprawidłowości jądrowe w erytrocytach o 5% i 20% przy najniższej (1 μg/l) i najwyższej (20 μg/l) dawce, odpowiednio. Na przykład zmiany w DNA gatunku mogą mieć poważne konsekwencje zarówno dla krótkoterminowego, jak i długoterminowego przetrwania, powodując spadek populacji, zmienioną sprawność reprodukcyjną, chów wsobny, utratę różnorodności genetycznej i zmienione wskaźniki migracji. Wszystkie te czynniki mogą mieć wpływ na przetrwanie i utrzymanie gatunku42,43. Powstawanie nieprawidłowości erytrocytów może wskazywać na blokadę cytokinezy, co skutkuje nieprawidłowym podziałem komórek (erytrocyty dwujądrowe)44,45; jądra wielopłatowe to wypukłości błony jądrowej z wieloma płatami46, podczas gdy inne nieprawidłowości erytrocytów mogą być związane z amplifikacją DNA, takie jak nerki jądrowe/pęcherzyki47. Obecność erytrocytów bezjądrowych może wskazywać na upośledzony transport tlenu, szczególnie w zanieczyszczonej wodzie48,49. Apoptoza wskazuje na śmierć komórki50.
Inne badania wykazały również genotoksyczne działanie cypermetryny. Kabaña i in.51 wykazali obecność mikrojąder i zmian jądrowych, takich jak komórki dwujądrowe i komórki apoptotyczne w komórkach Odontophrynus americanus po narażeniu na wysokie stężenia cypermetryny (5000 i 10 000 μg L−1) przez 96 godzin. Apoptozę wywołaną cypermetryną wykryto również u P. biligonigerus52 i Rhinella arenarum53. Wyniki te sugerują, że cypermetryna ma genotoksyczne działanie na szereg organizmów wodnych, a badanie MN i ENA może być wskaźnikiem subletalnych skutków dla płazów i może być stosowane w przypadku gatunków rodzimych i dzikich populacji narażonych na działanie substancji toksycznych12.
Komercyjne formulacje cypermetryny stanowią duże zagrożenie dla środowiska (zarówno ostre, jak i przewlekłe), przy czym HQ przekraczają poziom ustalony przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska (EPA)54, co może niekorzystnie wpłynąć na gatunek, jeśli jest obecny w środowisku. W ocenie ryzyka przewlekłego NOEC dla śmiertelności wyniosło 3 μg L−1, co potwierdza, że stężenia stwierdzone w wodzie mogą stanowić ryzyko dla gatunku55. Śmiertelne NOEC dla larw R. arenarum wystawionych na działanie mieszaniny endosulfanu i cypermetryny wyniosło 500 μg L−1 po 168 h; wartość ta spadła do 0,0005 μg L−1 po 336 h. Autorzy wykazują, że im dłuższa ekspozycja, tym niższe stężenia są szkodliwe dla gatunku. Ważne jest również podkreślenie, że wartości NOEC były wyższe niż wartości dla P. gracilis przy tym samym czasie ekspozycji, co wskazuje, że reakcja gatunku na cypermetrynę jest specyficzna dla gatunku. Ponadto, jeśli chodzi o śmiertelność, wartość CHQ P. gracilis po narażeniu na cypermetrynę osiągnęła 64,67, co jest wartością wyższą od wartości referencyjnej ustalonej przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska54, a wartość CHQ larw R. arenarum była również wyższa od tej wartości (CHQ > 388,00 po 336 h), co wskazuje, że badane insektycydy stanowią wysokie ryzyko dla kilku gatunków płazów. Biorąc pod uwagę, że P. gracilis potrzebuje około 30 dni, aby zakończyć metamorfozę56, można wnioskować, że badane stężenia cypermetryny mogą przyczyniać się do spadku populacji, zapobiegając wchodzeniu zakażonych osobników w stadium dorosłe lub reprodukcyjne we wczesnym wieku.
W obliczonej ocenie ryzyka mikrojąder i innych nieprawidłowości jądrowych erytrocytów wartości CHQ wahały się od 14,92 do 97,00, co wskazuje, że cypermetryna ma potencjalne ryzyko genotoksyczne dla P. gracilis nawet w jego naturalnym środowisku. Biorąc pod uwagę śmiertelność, maksymalne stężenie związków ksenobiotycznych tolerowane przez P. gracilis wynosiło 4,24 μg L−1. Jednak stężenia tak niskie jak 1 μg/L również wykazywały działanie genotoksyczne. Fakt ten może prowadzić do wzrostu liczby osobników nieprawidłowych57 i wpływać na rozwój i rozmnażanie gatunków w ich siedliskach, co prowadzi do spadku populacji płazów.
Komercyjne formulacje insektycydu cypermetryny wykazały wysoką ostrą i przewlekłą toksyczność dla P. gracilis. Zaobserwowano wyższe wskaźniki śmiertelności, prawdopodobnie z powodu toksycznych efektów, o czym świadczy obecność mikrojąder i nieprawidłowości jąder erytrocytów, zwłaszcza jąder ząbkowanych, jąder płatowatych i jąder pęcherzykowych. Ponadto badane gatunki wykazały zwiększone ryzyko środowiskowe, zarówno ostre, jak i przewlekłe. Dane te, w połączeniu z wcześniejszymi badaniami naszej grupy badawczej, wykazały, że nawet różne komercyjne formulacje cypermetryny nadal powodowały zmniejszoną aktywność acetylocholinoesterazy (AChE) i butyrylocholinoesterazy (BChE) oraz stres oksydacyjny58 i skutkowały zmianami w aktywności pływania i wadami rozwojowymi jamy ustnej59 u P. gracilis, co wskazuje, że komercyjne formulacje cypermetryny mają wysoką toksyczność śmiertelną i subletalną dla tego gatunku. Hartmann i in. 60 wykazało, że komercyjne formulacje cypermetryny były najbardziej toksyczne dla P. gracilis i innych gatunków tego samego rodzaju (P. cuvieri) w porównaniu z dziewięcioma innymi pestycydami. Sugeruje to, że prawnie zatwierdzone stężenia cypermetryny w celu ochrony środowiska mogą skutkować wysoką śmiertelnością i długoterminowym spadkiem populacji.
Potrzebne są dalsze badania, aby ocenić toksyczność pestycydu dla płazów, ponieważ stężenia występujące w środowisku mogą powodować wysoką śmiertelność i stanowić potencjalne ryzyko dla P. gracilis. Należy zachęcać do badań nad gatunkami płazów, ponieważ dane na temat tych organizmów są skąpe, szczególnie w przypadku gatunków brazylijskich.
Test toksyczności przewlekłej trwał 168 h (7 dni) w warunkach statycznych, a subletalne stężenia wynosiły: 1, 3, 6 i 20 μg ai L−1. W obu eksperymentach oceniano 10 kijanek na grupę leczoną w sześciu powtórzeniach, co łącznie dawało 60 kijanek na stężenie. Tymczasem leczenie wyłącznie wodą służyło jako kontrola negatywna. Każde eksperymentalne ustawienie składało się ze sterylnego naczynia szklanego o pojemności 500 ml i gęstości 1 kijanki na 50 ml roztworu. Kolbę przykryto folią polietylenową, aby zapobiec parowaniu i stale napowietrzano.
Wodę poddano analizie chemicznej w celu określenia stężeń pestycydów po 0, 96 i 168 h. Według Sabin et al. 68 i Martins et al. 69 analizy przeprowadzono w Pesticide Analysis Laboratory (LARP) Federal University of Santa Maria przy użyciu chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią masową potrójnego kwadrupola (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornia, USA). Ilościowe określenie pestycydów w wodzie przedstawiono jako materiał uzupełniający (Tabela SM1).
Do testu mikrojąderkowego (MNT) i testu nieprawidłowości jąder krwinek czerwonych (RNA) przeanalizowano 15 kijanek z każdej grupy leczonej. Kijanki znieczulono 5% lidokainą (50 mg g-170), a próbki krwi pobrano przez nakłucie serca przy użyciu jednorazowych strzykawek heparynizowanych. Rozmazy krwi przygotowano na sterylnych szkiełkach mikroskopowych, wysuszono na powietrzu, utrwalono 100% metanolem (4 °C) przez 2 min, a następnie barwiono 10% roztworem Giemsy przez 15 min w ciemności. Pod koniec procesu szkiełka przemyto wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru barwnika i wysuszono w temperaturze pokojowej.
Przynajmniej 1000 RBCs z każdej kijanki analizowano przy użyciu mikroskopu 100x z obiektywem 71, aby określić obecność MN i ENA. Łącznie oceniono 75 796 RBCs z kijanek, biorąc pod uwagę stężenia cypermetryny i kontrole. Genotoksyczność analizowano zgodnie z metodą Carrasco i in. oraz Fenech i in.38,72, określając częstość występowania następujących zmian jądrowych: (1) komórki bezjądrowe: komórki bez jąder; (2) komórki apoptotyczne: fragmentacja jądra, zaprogramowana śmierć komórki; (3) komórki dwujądrowe: komórki z dwoma jądrami; (4) pączki jądrowe lub komórki pęcherzykowe: komórki z jądrami z małymi wypustkami błony jądrowej, pęcherzyki podobne rozmiarem do mikrojąder; (5) komórki kariolizowane: komórki z jedynie zarysem jądra bez materiału wewnętrznego; (6) komórki karbowane: komórki z jądrami o widocznych pęknięciach lub karbach w kształcie, zwane również jądrami nerkowatymi; (7) komórki płatowate: komórki z wypustkami jąder większymi niż wspomniane pęcherzyki; i (8) mikrokomórki: komórki ze skondensowanymi jądrami i zredukowaną cytoplazmą. Zmiany porównano z wynikami kontroli negatywnej.
Wyniki testu toksyczności ostrej (LC50) analizowano przy użyciu oprogramowania GBasic i metody TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Dane z testu przewlekłego wstępnie testowano pod kątem normalności błędu (Shapiro-Wilks) i jednorodności wariancji (Bartlett). Wyniki analizowano przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Test Tukeya zastosowano do porównania danych między sobą, a test Dunnetta do porównania danych między grupą leczoną a grupą kontroli negatywnej.
Dane LOEC i NOEC analizowano przy użyciu testu Dunnetta. Testy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Statistica 8.0 (StatSoft) z poziomem istotności 95% (p < 0,05).
Czas publikacji: 13-03-2025