W badaniu tym oceniono śmiertelność, subśmiertelność i toksyczność komercyjnychcypermetrynapreparaty na kijanki bezogonowe. W teście ostrym testowano stężenia 100–800 μg/l przez 96 godzin. W teście przewlekłym testowano naturalnie występujące stężenia cypermetryny (1, 3, 6 i 20 μg/l) pod kątem śmiertelności, a następnie wykonywano badanie mikrojąder i nieprawidłowości jądrowych czerwonych krwinek przez 7 dni. LC50 komercyjnego preparatu cypermetryny na kijanki wynosiło 273,41 μg L−1. W teście przewlekłym najwyższe stężenie (20 μg L−1) skutkowało śmiertelnością większą niż 50%, ponieważ zabijało połowę badanych kijanek. Test mikrojąder wykazał istotne wyniki przy stężeniu 6 i 20 μg L−1 i wykryto kilka nieprawidłowości jądrowych, co wskazuje, że komercyjny preparat cypermetryny ma potencjał genotoksyczny wobec P. gracilis. Cypermetryna stanowi wysokie ryzyko dla tego gatunku, co wskazuje, że może powodować liczne problemy i wpływać na dynamikę tego ekosystemu w perspektywie krótko- i długoterminowej. W związku z tym można stwierdzić, że komercyjne preparaty cypermetryny mają toksyczny wpływ na P. gracilis.
W związku z ciągłą ekspansją działalności rolniczej i intensywnym stosowaniemzwalczanie szkodnikówW związku z tym zwierzęta wodne są często narażone na działanie pestycydów1,2. Zanieczyszczenie zasobów wodnych w pobliżu pól uprawnych może wpływać na rozwój i przetrwanie organizmów niebędących przedmiotem zwalczania, takich jak płazy.
Płazy odgrywają coraz ważniejszą rolę w ocenie matryc środowiskowych. Bezogonowe są uważane za dobre bioindykatory zanieczyszczeń środowiska ze względu na ich unikalne cechy, takie jak złożone cykle życiowe, szybkie tempo wzrostu larw, status troficzny, przepuszczalna skóra10,11, zależność od wody w procesie rozmnażania12 oraz jaja bez ochrony11,13,14. Mała żaba wodna (Physalaemus gracilis), powszechnie znana jako żaba płacząca, okazała się gatunkiem bioindykatorowym zanieczyszczenia pestycydami4,5,6,7,15. Gatunek ten występuje w wodach stojących, obszarach chronionych lub obszarach o zróżnicowanym siedlisku w Argentynie, Urugwaju, Paragwaju i Brazylii1617 i jest uważany za gatunek stabilny według klasyfikacji IUCN ze względu na szerokie rozprzestrzenienie i tolerancję na zróżnicowane siedliska18.
Zgłaszano subletalne skutki u płazów po narażeniu na cypermetrynę, w tym zmiany behawioralne, morfologiczne i biochemiczne u kijanek23,24,25, wydłużenie śmiertelności i czasu metamorfozy, zmiany enzymatyczne, zmniejszenie liczby wylęgów24,25, nadpobudliwość26, zahamowanie aktywności cholinoesterazy27 oraz zmiany w wydolności pływackiej7,28. Jednakże badania nad genotoksycznym działaniem cypermetryny u płazów są ograniczone. Dlatego ważne jest, aby ocenić wrażliwość gatunków bezogonowych na cypermetrynę.
Zanieczyszczenie środowiska wpływa na prawidłowy wzrost i rozwój płazów, ale najpoważniejszym negatywnym skutkiem jest uszkodzenie genetyczne DNA spowodowane ekspozycją na pestycydy13. Analiza morfologii krwinek jest ważnym bioindykatorem zanieczyszczenia i potencjalnej toksyczności substancji dla gatunków dzikich29. Test mikrojądrowy jest jedną z najczęściej stosowanych metod określania genotoksyczności substancji chemicznych w środowisku30. Jest to szybka, skuteczna i niedroga metoda, która jest dobrym wskaźnikiem zanieczyszczenia chemicznego organizmów takich jak płazy31,32 i może dostarczyć informacji na temat narażenia na zanieczyszczenia genotoksyczne33.
Celem niniejszego badania była ocena toksycznego wpływu komercyjnych preparatów cypermetryny na małe kijanki wodne przy użyciu testu mikrojądrowego i oceny ryzyka ekologicznego.
Skumulowana śmiertelność (%) kijanek P. gracilis narażonych na różne stężenia komercyjnej cypermetryny w ostrej fazie badania.
Skumulowana śmiertelność (%) kijanek P. gracilis narażonych na różne stężenia komercyjnej cypermetryny podczas testu przewlekłego.
Obserwowana wysoka śmiertelność była wynikiem działania genotoksycznego u płazów narażonych na różne stężenia cypermetryny (6 i 20 μg/l), o czym świadczy obecność mikrojąder (MN) i nieprawidłowości jądrowych w erytrocytach. Powstawanie MN wskazuje na błędy mitozy i jest związane ze słabym wiązaniem chromosomów do mikrotubul, defektami w kompleksach białkowych odpowiedzialnych za wychwyt i transport chromosomów, błędami w segregacji chromosomów oraz błędami w naprawie uszkodzeń DNA38,39 i może być związane ze stresem oksydacyjnym wywołanym pestycydami40,41. Inne nieprawidłowości obserwowano przy wszystkich ocenianych stężeniach. Zwiększanie stężeń cypermetryny zwiększało nieprawidłowości jądrowe w erytrocytach o 5% i 20% odpowiednio przy najniższej (1 μg/l) i najwyższej (20 μg/l) dawce. Na przykład zmiany w DNA gatunku mogą mieć poważne konsekwencje zarówno dla krótko-, jak i długoterminowego przetrwania, skutkując spadkiem populacji, zaburzeniami zdolności reprodukcyjnej, chowem wsobnym, utratą różnorodności genetycznej i zmianami w tempie migracji. Wszystkie te czynniki mogą wpływać na przetrwanie i utrzymanie gatunku42,43. Powstawanie nieprawidłowości erytrocytów może wskazywać na zablokowanie cytokinezy, co prowadzi do nieprawidłowych podziałów komórkowych (erytrocyty dwujądrowe)44,45; jądra wielopłatowe to wypustki błony jądrowej z wieloma płatami46, podczas gdy inne nieprawidłowości erytrocytów mogą być związane z amplifikacją DNA, takie jak nerki jądrowe/pęcherzyki47. Obecność erytrocytów bezjądrowych może wskazywać na upośledzony transport tlenu, szczególnie w zanieczyszczonej wodzie48,49. Apoptoza wskazuje na śmierć komórki50.
Inne badania również wykazały genotoksyczne działanie cypermetryny. Kabaña i wsp. [51] wykazali obecność mikrojąder i zmian jądrowych, takich jak komórki dwujądrowe i komórki apoptotyczne w komórkach Odontophrynus americanus po ekspozycji na wysokie stężenia cypermetryny (5000 i 10 000 μg L−1) przez 96 godzin. Apoptozę indukowaną cypermetryną wykryto również u P. biligonigerus [52] i Rhinella arenarum [53]. Wyniki te sugerują, że cypermetryna ma działanie genotoksyczne na szereg organizmów wodnych, a test MN i ENA może być wskaźnikiem subletalnego wpływu na płazy i może być stosowany w przypadku gatunków rodzimych i dzikich populacji narażonych na działanie substancji toksycznych [12].
Komercyjne formulacje cypermetryny stanowią wysokie zagrożenie dla środowiska (zarówno ostre, jak i przewlekłe), przy czym HQ przekraczają poziom ustalony przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (EPA)54, co może niekorzystnie wpływać na gatunek, jeśli jest obecny w środowisku. W ocenie ryzyka przewlekłego NOEC dla śmiertelności wyniosło 3 μg L−1, co potwierdza, że stężenia stwierdzone w wodzie mogą stanowić zagrożenie dla gatunku55. Śmiertelne NOEC dla larw R. arenarum wystawionych na działanie mieszaniny endosulfanu i cypermetryny wyniosło 500 μg L−1 po 168 h; wartość ta spadła do 0,0005 μg L−1 po 336 h. Autorzy wykazują, że im dłuższa ekspozycja, tym niższe stężenia są szkodliwe dla gatunku. Ważne jest również podkreślenie, że wartości NOEC były wyższe niż dla P. gracilis przy tym samym czasie ekspozycji, co wskazuje, że reakcja gatunku na cypermetrynę jest specyficzna dla gatunku. Co więcej, pod względem śmiertelności, wartość CHQ dla P. gracilis po ekspozycji na cypermetrynę osiągnęła 64,67, co jest wartością wyższą od wartości referencyjnej ustalonej przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (EPA)54, a wartość CHQ dla larw R. arenarum również była wyższa od tej wartości (CHQ > 388,00 po 336 h), co wskazuje, że badane insektycydy stanowią wysokie ryzyko dla kilku gatunków płazów. Biorąc pod uwagę, że P. gracilis potrzebuje około 30 dni na pełną metamorfozę56, można wnioskować, że badane stężenia cypermetryny mogą przyczyniać się do spadku populacji, uniemożliwiając zakażonym osobnikom wejście w stadium dorosłe lub reprodukcyjne we wczesnym wieku.
W obliczonej ocenie ryzyka mikrojąder i innych nieprawidłowości jądrowych erytrocytów, wartości CHQ wahały się od 14,92 do 97,00, co wskazuje, że cypermetryna stanowi potencjalne ryzyko genotoksyczne dla P. gracilis, nawet w jego naturalnym środowisku. Biorąc pod uwagę śmiertelność, maksymalne stężenie związków ksenobiotycznych tolerowane przez P. gracilis wynosiło 4,24 μg L−1. Jednakże stężenia tak niskie, jak 1 μg/L, również wykazywały działanie genotoksyczne. Fakt ten może prowadzić do wzrostu liczby osobników z anomaliami57 i wpływać na rozwój i rozmnażanie gatunków w ich siedliskach, prowadząc do spadku populacji płazów.
Komercyjne formulacje insektycydu cypermetryny wykazały wysoką toksyczność ostrą i przewlekłą dla P. gracilis. Obserwowano wyższe wskaźniki śmiertelności, prawdopodobnie z powodu działania toksycznego, o czym świadczy obecność mikrojąder i nieprawidłowości jąder erytrocytów, zwłaszcza jąder ząbkowanych, płatowatych i pęcherzykowych. Ponadto badane gatunki wykazywały zwiększone ryzyko środowiskowe, zarówno ostre, jak i przewlekłe. Dane te, w połączeniu z wcześniejszymi badaniami naszej grupy badawczej, wykazały, że nawet różne komercyjne formulacje cypermetryny nadal powodowały obniżenie aktywności acetylocholinoesterazy (AChE) i butyrylocholinoesterazy (BChE) oraz stres oksydacyjny58, a także skutkowały zmianami w aktywności pływania i wadami rozwojowymi jamy ustnej59 u P. gracilis, co wskazuje, że komercyjne formulacje cypermetryny wykazują wysoką toksyczność letalną i subletalną dla tego gatunku. Hartmann i in. 60 wykazało, że komercyjne preparaty cypermetryny były najbardziej toksyczne dla P. gracilis i innego gatunku z tego samego rodzaju (P. cuvieri) w porównaniu z dziewięcioma innymi pestycydami. Sugeruje to, że stężenia cypermetryny zatwierdzone prawnie w celu ochrony środowiska mogą prowadzić do wysokiej śmiertelności i długotrwałego spadku populacji.
Konieczne są dalsze badania w celu oceny toksyczności pestycydu dla płazów, ponieważ stężenia występujące w środowisku mogą powodować wysoką śmiertelność i stanowić potencjalne zagrożenie dla P. gracilis. Należy zachęcać do badań nad gatunkami płazów, ponieważ dane na temat tych organizmów są skąpe, zwłaszcza w odniesieniu do gatunków brazylijskich.
Test toksyczności przewlekłej trwał 168 godzin (7 dni) w warunkach statycznych, a stężenia subletalne wynosiły: 1, 3, 6 i 20 μg ai L−1. W obu eksperymentach oceniano 10 kijanek w każdej grupie badanej w sześciu powtórzeniach, co łącznie dawało 60 kijanek na stężenie. Próba z samą wodą stanowiła kontrolę negatywną. Każdy zestaw eksperymentalny składał się ze sterylnej szklanej szalki o pojemności 500 ml i gęstości 1 kijanki na 50 ml roztworu. Kolbę przykryto folią polietylenową, aby zapobiec parowaniu, i stale napowietrzano.
Wodę poddano analizie chemicznej w celu określenia stężeń pestycydów po 0, 96 i 168 godzinach. Według Sabin i in. 68 oraz Martins i in. 69, analizy przeprowadzono w Laboratorium Analizy Pestycydów (LARP) Federalnego Uniwersytetu Santa Maria, stosując chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas z potrójnym kwadrupolem (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornia, USA). Ilościowe oznaczenie pestycydów w wodzie przedstawiono jako materiał uzupełniający (tabela SM1).
Do testu mikrojąderkowego (MNT) i testu nieprawidłowości jąder krwinek czerwonych (RNA) przeanalizowano 15 kijanek z każdej grupy badanej. Kijanki znieczulono 5% lidokainą (50 mg g-170), a próbki krwi pobrano przez nakłucie serca za pomocą jednorazowych strzykawek heparynizowanych. Rozmazy krwi sporządzono na sterylnych szkiełkach mikroskopowych, wysuszono na powietrzu, utrwalono w 100% metanolu (4°C) przez 2 minuty, a następnie barwiono 10% roztworem Giemsy przez 15 minut w ciemności. Po zakończeniu procesu szkiełka przemyto wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru barwnika i wysuszono w temperaturze pokojowej.
Przynajmniej 1000 RBCs z każdej kijanki analizowano przy użyciu mikroskopu 100x z obiektywem 71 w celu określenia obecności MN i ENA. Łącznie oceniono 75 796 RBCs z kijanek, biorąc pod uwagę stężenia cypermetryny i kontrole. Genotoksyczność analizowano zgodnie z metodą Carrasco i in. oraz Fenech i in.38,72, określając częstość występowania następujących zmian jądrowych: (1) komórki bezjądrowe: komórki bez jąder; (2) komórki apoptotyczne: fragmentacja jądra, programowana śmierć komórki; (3) komórki dwujądrowe: komórki z dwoma jądrami; (4) pączki jądrowe lub komórki pęcherzykowe: komórki z jądrami z małymi wypustkami błony jądrowej, pęcherzyki o rozmiarze podobnym do mikrojąder; (5) komórki kariolizowane: komórki z jedynie zarysem jądra bez materiału wewnętrznego; (6) komórki karbowane: komórki z jądrami o wyraźnych pęknięciach lub karbach w kształcie, zwane również jądrami nerkowatymi; (7) komórki zrazikowe: komórki z wypustkami jąder większymi niż wspomniane pęcherzyki; oraz (8) mikrokomórki: komórki o skondensowanych jądrach i zredukowanej cytoplazmie. Zmiany porównano z wynikami kontroli negatywnej.
Wyniki testu toksyczności ostrej (LC50) analizowano za pomocą oprogramowania GBasic i metody Spearmana-Karbera TSK-Trimmed74. Dane z testu przewlekłego wstępnie przetestowano pod kątem normalności rozkładu błędów (Shapiro-Wilks) i jednorodności wariancji (Bartlett). Wyniki analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Do porównania danych między sobą zastosowano test Tukeya, a do porównania danych między grupą leczoną a grupą kontroli negatywnej – test Dunnetta.
Dane LOEC i NOEC analizowano za pomocą testu Dunnetta. Testy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Statistica 8.0 (StatSoft) z poziomem istotności 95% (p < 0,05).
Czas publikacji: 13 marca 2025 r.