Powszechne stosowanie syntetycznych pestycydów doprowadziło do wielu problemów, w tym pojawienia się organizmów opornych, degradacji środowiska i szkód dla zdrowia ludzi. W związku z tym opracowano nowe środki mikrobiologiczne.pestycydyPilnie potrzebne są bezpieczne dla zdrowia ludzkiego i środowiska środki powierzchniowo czynne. W tym badaniu biosurfaktant ramnolipidowy wytwarzany przez Enterobacter cloacae SJ2 został użyty do oceny toksyczności dla larw komarów (Culex quinquefasciatus) i termitów (Odontotermes obesus). Wyniki wykazały, że między zabiegami występowała zależna od dawki śmiertelność. Wartość LC50 (50% stężenia śmiertelnego) po 48 godzinach dla biosurfaktantów termitów i larw komarów została określona przy użyciu metody dopasowania krzywej regresji nieliniowej. Wyniki wykazały, że 48-godzinne wartości LC50 (95% przedział ufności) aktywności larwicydowej i przeciwtermitowej biosurfaktantu wynosiły odpowiednio 26,49 mg/l (zakres 25,40–27,57) i 33,43 mg/l (zakres 31,09–35,68). Według badania histopatologicznego, leczenie biosurfaktantami spowodowało poważne uszkodzenia tkanek organelli larw i termitów. Wyniki tego badania wskazują, że mikrobiologiczny biosurfaktant wytwarzany przez Enterobacter cloacae SJ2 jest doskonałym i potencjalnie skutecznym narzędziem zwalczania Cx. quinquefasciatus i O. obesus.
Kraje tropikalne doświadczają dużej liczby chorób przenoszonych przez komary1. Znaczenie chorób przenoszonych przez komary jest powszechne. Ponad 400 000 osób umiera na malarię każdego roku, a w niektórych dużych miastach występują epidemie poważnych chorób, takich jak denga, żółta febra, chikungunya i Zika.2 Choroby przenoszone przez wektory są związane z jedną na sześć infekcji na świecie, przy czym komary powodują najpoważniejsze przypadki3,4. Culex, Anopheles i Aedes to trzy rodzaje komarów najczęściej związane z przenoszeniem chorób5. Częstość występowania dengi, infekcji przenoszonej przez komara Aedes aegypti, wzrosła w ciągu ostatniej dekady i stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego4,7,8. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) ponad 40% populacji świata jest narażonych na dengę, a 50–100 milionów nowych przypadków pojawia się rocznie w ponad 100 krajach9,10,11. Gorączka denga stała się poważnym problemem zdrowia publicznego, ponieważ jej częstość występowania wzrosła na całym świecie12,13,14. Anopheles gambiae, powszechnie znany jako afrykański komar Anopheles, jest najważniejszym wektorem malarii u ludzi w regionach tropikalnych i subtropikalnych15. Wirus Zachodniego Nilu, zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego St. Louis, japońskie zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego oraz wirusowe infekcje koni i ptaków są przenoszone przez komary Culex, często nazywane komarami domowymi. Ponadto są one również nosicielami chorób bakteryjnych i pasożytniczych16. Na świecie istnieje ponad 3000 gatunków termitów, które występują od ponad 150 milionów lat17. Większość szkodników żyje w glebie i żywi się drewnem oraz produktami drzewnymi zawierającymi celulozę. Termit indyjski Odontotermes obesus jest poważnym szkodnikiem, który powoduje poważne szkody w ważnych uprawach i drzewach plantacyjnych18. Na obszarach rolniczych inwazje termitów w różnych stadiach mogą powodować ogromne szkody gospodarcze w różnych uprawach, gatunkach drzew i materiałach budowlanych. Termity mogą również powodować problemy zdrowotne u ludzi19.
Problem oporności mikroorganizmów i szkodników we współczesnym przemyśle farmaceutycznym i rolniczym jest złożony20,21. Dlatego obie firmy powinny poszukiwać nowych, opłacalnych środków przeciwdrobnoustrojowych i bezpiecznych biopestycydów. Syntetyczne pestycydy są obecnie dostępne i wykazano, że są zakaźne i odstraszają pożyteczne owady niebędące obiektem zainteresowania22. W ostatnich latach badania nad biosurfaktantami poszerzyły się ze względu na ich zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu. Biosurfaktanty są bardzo przydatne i niezbędne w rolnictwie, remediacji gleb, wydobyciu ropy naftowej, usuwaniu bakterii i owadów oraz przetwórstwie żywności23,24. Biosurfaktanty lub surfaktanty mikrobiologiczne to związki chemiczne biosurfaktantów wytwarzane przez mikroorganizmy, takie jak bakterie, drożdże i grzyby, w siedliskach przybrzeżnych i obszarach zanieczyszczonych ropą naftową25,26. Surfaktanty pochodzenia chemicznego i biosurfaktanty to dwa rodzaje biosurfaktantów pozyskiwanych bezpośrednio ze środowiska naturalnego27. Różne biosurfaktanty pozyskuje się z siedlisk morskich28,29. Dlatego naukowcy poszukują nowych technologii produkcji biosurfaktantów na bazie naturalnych bakterii30,31. Postępy w tych badaniach dowodzą znaczenia tych związków biologicznych dla ochrony środowiska32. Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Corynebacterium i te rodzaje bakterii są dobrze poznanymi przedstawicielami23,33.
Istnieje wiele rodzajów biosurfaktantów o szerokim zakresie zastosowań34. Istotną zaletą tych związków jest to, że niektóre z nich wykazują działanie przeciwbakteryjne, larwobójcze i owadobójcze. Oznacza to, że mogą być stosowane w przemyśle rolniczym, chemicznym, farmaceutycznym i kosmetycznym35,36,37,38. Ponieważ biosurfaktanty są na ogół biodegradowalne i korzystne dla środowiska, są stosowane w programach zintegrowanego zwalczania szkodników w celu ochrony upraw39. W ten sposób uzyskano podstawową wiedzę na temat aktywności larwobójczej i przeciwtermitowej mikrobiologicznych biosurfaktantów wytwarzanych przez Enterobacter cloacae SJ2. Zbadaliśmy śmiertelność i zmiany histologiczne po ekspozycji na różne stężenia biosurfaktantów ramnolipidowych. Ponadto, dokonaliśmy oceny powszechnie stosowanego programu komputerowego QSAR (Quantitative Structure-Activity) Ecological Structure-Activity (ECOSAR) w celu określenia ostrej toksyczności dla mikroalg, dafni i ryb.
W niniejszym badaniu przetestowano działanie przeciwtermitowe (toksyczność) oczyszczonych biosurfaktantów w różnych stężeniach, od 30 do 50 mg/ml (w odstępach co 5 mg/ml), na termitach indyjskich, O. obesus i czwartym gatunku. Ocena. Larwy w stadium larwalnym Cx. Larwy komarów quinquefasciatus. Stężenia biosurfaktantów LC50 w ciągu 48 godzin dla O. obesus i Cx. C. solanacearum. Larwy komarów zidentyfikowano za pomocą metody dopasowania krzywej regresji nieliniowej. Wyniki wykazały, że śmiertelność termitów wzrastała wraz ze wzrostem stężenia biosurfaktantu. Wyniki wykazały, że biosurfaktant ma działanie larwobójcze (rysunek 1) i działanie przeciwtermitowe (rysunek 2), przy 48-godzinnych wartościach LC50 (95% CI) wynoszących odpowiednio 26,49 mg/l (25,40 do 27,57) i 33,43 mg/l (rysunek 31.09 do 35,68) (tabela 1). Pod względem ostrej toksyczności (48 godzin) biosurfaktant jest klasyfikowany jako „szkodliwy” dla badanych organizmów. Biosurfaktant wytworzony w tym badaniu wykazał doskonałą aktywność larwobójczą ze 100% śmiertelnością w ciągu 24-48 godzin od narażenia.
Oblicz wartość LC50 dla aktywności larwobójczej. Dopasowanie krzywej regresji nieliniowej (linia ciągła) i 95% przedział ufności (obszar zacieniony) dla śmiertelności względnej (%).
Oblicz wartość LC50 dla aktywności przeciwtermitowej. Dopasowanie krzywej regresji nieliniowej (linia ciągła) i 95% przedział ufności (obszar zacieniony) dla śmiertelności względnej (%).
Pod koniec eksperymentu zaobserwowano zmiany morfologiczne i anomalie pod mikroskopem. Zmiany morfologiczne zaobserwowano w grupie kontrolnej i grupie leczonej przy powiększeniu 40x. Jak pokazano na rysunku 3, u większości larw poddanych działaniu biosurfaktantów wystąpiły zaburzenia wzrostu. Rysunek 3a przedstawia prawidłowy Cx. quinquefasciatus, a rysunek 3b przedstawia anomalię Cx. Powoduje pięć larw nicieni.
Wpływ subletalnych (LC50) dawek biosurfaktantów na rozwój larw Culex quinquefasciatus. Obraz mikroskopu świetlnego (a) przedstawiający normalny Cx przy powiększeniu 40×. quinquefasciatus (b) Nieprawidłowy Cx. Powoduje pięć larw nicieni.
W niniejszym badaniu badanie histologiczne leczonych larw (ryc. 4) i termitów (ryc. 5) ujawniło szereg nieprawidłowości, w tym zmniejszenie powierzchni brzucha oraz uszkodzenia mięśni, warstw nabłonka i skóry. Badanie histologiczne ujawniło mechanizm działania hamującego biosurfaktantu stosowanego w tym badaniu.
Histopatologia zdrowych, nieleczonych larw Cx w czwartym stadium rozwojowym. Larwy quinquefasciatus (kontrola: (a, b)) i leczone biosurfaktantem (leczenie: (c, d)). Strzałki wskazują leczony nabłonek jelitowy (epi), jądra komórkowe (n) i mięsień (mu). Słupek = 50 µm.
Histopatologia prawidłowego, nieleczonego O. obesus (kontrola: (a, b)) i leczonego biosurfaktantem (leczenie: (c, d)). Strzałki wskazują odpowiednio nabłonek jelitowy (epi) i mięsień (mu). Słupek = 50 µm.
W niniejszym badaniu wykorzystano ECOSAR do przewidywania ostrej toksyczności produktów biosurfaktantów ramnolipidowych dla producentów pierwotnych (zielenice), konsumentów pierwotnych (rozwielitki) i konsumentów wtórnych (ryby). Program ten wykorzystuje zaawansowane ilościowe modele struktura-aktywność związków do oceny toksyczności na podstawie struktury molekularnej. Model wykorzystuje oprogramowanie struktura-aktywność (SAR) do obliczania ostrej i długotrwałej toksyczności substancji dla gatunków wodnych. W Tabeli 2 podsumowano szacunkowe średnie stężenia śmiertelne (LC50) i średnie stężenia efektywne (EC50) dla kilku gatunków. Podejrzewana toksyczność została podzielona na cztery poziomy zgodnie z Globalnie Zharmonizowanym Systemem Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (Tabela 3).
Kontrola chorób przenoszonych przez wektory, zwłaszcza szczepów komarów i komarów Aedes. Egipcjanie, teraz trudna praca 40,41,42,43,44,45,46. Chociaż niektóre chemicznie dostępne pestycydy, takie jak pyretroidy i organofosforany, są w pewnym stopniu korzystne, stanowią one znaczne ryzyko dla zdrowia ludzi, w tym cukrzycę, zaburzenia rozrodcze, zaburzenia neurologiczne, raka i choroby układu oddechowego. Ponadto z czasem owady te mogą stać się na nie odporne13,43,48. W związku z tym skuteczne i przyjazne dla środowiska biologiczne środki kontroli staną się bardziej popularną metodą zwalczania komarów49,50. Benelli51 zasugerował, że wczesna kontrola komarów przenoszących wektory będzie skuteczniejsza na obszarach miejskich, ale nie zalecał stosowania larwicydów na obszarach wiejskich52. Tom i in.53 zasugerowali również, że zwalczanie komarów w ich niedojrzałych stadiach będzie bezpieczną i prostą strategią, ponieważ są one bardziej wrażliwe na środki kontroli54.
Produkcja biosurfaktantu przez silny szczep (Enterobacter cloacae SJ2) wykazała spójną i obiecującą skuteczność. Nasze poprzednie badanie wykazało, że Enterobacter cloacae SJ2 optymalizuje produkcję biosurfaktantu za pomocą parametrów fizykochemicznych26. Według ich badania, optymalne warunki produkcji biosurfaktantu przez potencjalny izolat E. cloacae to inkubacja przez 36 godzin, mieszanie z prędkością 150 obr./min, pH 7,5, 37°C, zasolenie 1 ppt, 2% glukoza jako źródło węgla, 1% drożdże. Ekstrakt wykorzystano jako źródło azotu, aby uzyskać 2,61 g/l biosurfaktantu. Ponadto biosurfaktanty scharakteryzowano za pomocą TLC, FTIR i MALDI-TOF-MS. Potwierdziło to, że ramnolipid jest biosurfaktantem. Biosurfaktanty glikolipidowe stanowią najintensywniej badaną klasę innych rodzajów biosurfaktantów55. Składają się z części węglowodanowych i lipidowych, głównie łańcuchów kwasów tłuszczowych. Wśród glikolipidów głównymi przedstawicielami są ramnolipid i soforolipid56. Ramnolipidy zawierają dwa fragmenty ramnozy połączone z kwasem mono- lub di-β-hydroksydekanowym57. Zastosowanie ramnolipidów w przemyśle medycznym i farmaceutycznym jest dobrze ugruntowane58, oprócz ich niedawnego zastosowania jako pestycydów59.
Interakcja biosurfaktantu z hydrofobowym obszarem syfonu oddechowego umożliwia przepływ wody przez jego jamę szparkową, zwiększając w ten sposób kontakt larw ze środowiskiem wodnym. Obecność biosurfaktantów wpływa również na tchawicę, której długość jest bliska powierzchni, co ułatwia larwom wydostawanie się na powierzchnię i oddychanie. W rezultacie napięcie powierzchniowe wody maleje. Ponieważ larwy nie mogą przyczepić się do powierzchni wody, opadają na dno zbiornika, zakłócając ciśnienie hydrostatyczne, co skutkuje nadmiernym wydatkiem energii i śmiercią przez utonięcie38,60. Podobne wyniki uzyskał Ghribi61, gdzie biosurfaktant wytwarzany przez Bacillus subtilis wykazywał działanie larwobójcze wobec Ephestia kuehniella. Podobnie, aktywność larwobójcza Cx. Das i Mukherjee23 również ocenili wpływ cyklicznych lipopeptydów na larwy quinquefasciatus.
Wyniki niniejszego badania dotyczą larwobójczego działania biosurfaktantów ramnolipidowych na Cx. Skuteczność zabijania komarów z rodzaju Quinquefasciatus jest zgodna z wcześniej opublikowanymi wynikami. Na przykład, stosowane są biosurfaktanty na bazie surfaktantów, produkowane przez różne bakterie z rodzaju Bacillus i Pseudomonas spp. Niektóre wczesne doniesienia64,65,66 donoszą o larwalnobójczym działaniu biosurfaktantów lipopeptydowych z Bacillus subtilis23. Deepali i in.63 stwierdzili, że biosurfaktant ramnolipidowy wyizolowany ze Stenotropomonas maltophilia wykazuje silne działanie larwobójcze w stężeniu 10 mg/l. Silva i in.67 opisali larwobójcze działanie biosurfaktantu ramnolipidowego na Ae w stężeniu 1 g/l. Aedes aegypti. Kanakdande i in. 68 donieśli, że biosurfaktanty lipopeptydowe wytwarzane przez Bacillus subtilis powodowały ogólną śmiertelność larw Culex i termitów z lipofilową frakcją eukaliptusa. Podobnie Masendra i in. 69 opisali śmiertelność mrówek robotnic (Cryptotermes cynocephalus Light.) na poziomie 61,7% w lipofilowych frakcjach n-heksanu i EtOAc surowego ekstraktu z E.
Parthipan i wsp. [70] opisali owadobójcze zastosowanie biosurfaktantów lipopeptydowych wytwarzanych przez Bacillus subtilis A1 i Pseudomonas stutzeri NA3 przeciwko Anopheles Stephensi, nosicielowi malarii Plasmodium. Zaobserwowali, że larwy i poczwarki przeżywały dłużej, miały krótszy okres składania jaj, były jałowe i miały krótszy okres życia po zastosowaniu różnych stężeń biosurfaktantów. Obserwowane wartości LC50 biosurfaktantu A1 z B. subtilis wynosiły odpowiednio 3,58, 4,92, 5,37, 7,10 i 7,99 mg/l dla różnych stadiów larwalnych (tj. larw I, II, III, IV i stadium poczwarki). Dla porównania, stężenia biosurfaktantów w stadiach larwalnych I-IV i poczwarkowych Pseudomonas stutzeri NA3 wynosiły odpowiednio 2,61, 3,68, 4,48, 5,55 i 6,99 mg/l. Uważa się, że opóźniona fenologia przeżywających larw i poczwarek jest wynikiem istotnych zaburzeń fizjologicznych i metabolicznych wywołanych przez insektycydy71.
Szczep Wickerhamomyces anomalus CCMA 0358 wytwarza biosurfaktant o 100% aktywności larwobójczej wobec komarów Aedes. aegypti w 24-godzinnym odstępie czasu 38 był wyższy niż raportowany przez Silvę i in. Wykazano, że biosurfaktant wyprodukowany z Pseudomonas aeruginosa z wykorzystaniem oleju słonecznikowego jako źródła węgla zabija 100% larw w ciągu 48 godzin 67 . Abinaya i in. 72 oraz Pradhan i in. 73 również wykazali larwobójcze lub owadobójcze działanie surfaktantów wytwarzanych przez kilka izolatów z rodzaju Bacillus. Wcześniej opublikowane badanie Senthil-Nathan i in. wykazało, że 100% larw komarów wystawionych na działanie lagun roślinnych prawdopodobnie ginęło. 74.
Ocena subletalnego wpływu insektycydów na biologię owadów ma kluczowe znaczenie dla programów zintegrowanego zwalczania szkodników, ponieważ dawki/stężenia subletalne nie zabijają owadów, ale mogą zmniejszać populacje owadów w przyszłych pokoleniach poprzez zaburzanie ich cech biologicznych10. Siqueira i in. 75 zaobserwowali całkowitą aktywność larwobójczą (100% śmiertelności) biosurfaktantu ramnolipidowego (300 mg/ml) w testach w różnych stężeniach, od 50 do 300 mg/ml. Stadium larwalne szczepów Aedes aegypti. Przeanalizowali wpływ czasu do śmierci i stężeń subletalnych na przeżywalność larw i aktywność pływacką. Ponadto zaobserwowali spadek prędkości pływania po 24–48 godzinach ekspozycji na subletalne stężenia biosurfaktantu (np. 50 mg/ml i 100 mg/ml). Uważa się, że trucizny o obiecującej roli subletalnej są skuteczniejsze w powodowaniu wielokrotnych uszkodzeń u narażonych szkodników76.
Histologiczne obserwacje naszych wyników wskazują, że biosurfaktanty wytwarzane przez Enterobacter cloacae SJ2 znacząco zmieniają tkanki larw komarów (Cx. quinquefasciatus) i termitów (O. obesus). Podobne anomalie powodowane przez preparaty olejku bazyliowego u larw An. gambiaes.s i An. arabica opisał Ochola77. Kamaraj i wsp.78 również opisali te same nieprawidłowości morfologiczne u larw An. Stephanie's, które były wystawione na działanie nanocząsteczek złota. Vasantha-Srinivasan i wsp.79 również donieśli, że olejek eteryczny z tasznika pospolitego poważnie uszkodził komorę i warstwy nabłonkowe komarów Aedes albopictus i Aedes aegypti. Raghavendran i wsp. donieśli, że larwy komarów były traktowane ekstraktem z grzybni lokalnego grzyba Penicillium o stężeniu 500 mg/ml. Ae wykazują poważne uszkodzenia histologiczne. aegypti i Cx. Współczynnik śmiertelności 80. Wcześniej Abinaya i in. badali larwy An w czwartym stadium rozwojowym. Stephensi i Ae. aegypti zaobserwowali liczne zmiany histologiczne u komarów Aedes aegypti leczonych egzopolisacharydami B. licheniformis, w tym jelito ślepe, zanik mięśni, uszkodzenia i dezorganizację zwojów nerwowych72. Według Raghavendrana i in., po leczeniu ekstraktem z grzybni P. daleae, komórki jelita środkowego badanych komarów (larw w czwartym stadium rozwojowym) wykazywały obrzęk światła jelita, zmniejszenie zawartości międzykomórkowej i degenerację jądra komórkowego81. Te same zmiany histologiczne zaobserwowano u larw komarów leczonych ekstraktem z liści jeżówki, co wskazuje na potencjał owadobójczy związków poddanych działaniu tych związków50.
Zastosowanie oprogramowania ECOSAR zyskało międzynarodowe uznanie82. Aktualne badania sugerują, że ostra toksyczność biosurfaktantów ECOSAR dla mikroalg (C. vulgaris), ryb i pcheł wodnych (D. magna) mieści się w kategorii „toksyczności” zdefiniowanej przez Organizację Narodów Zjednoczonych83. Model ekotoksyczności ECOSAR wykorzystuje SAR i QSAR do przewidywania ostrej i długotrwałej toksyczności substancji i jest często wykorzystywany do przewidywania toksyczności zanieczyszczeń organicznych82,84.
Paraformaldehyd, bufor fosforanu sodu (pH 7,4) i wszystkie inne substancje chemiczne użyte w tym badaniu zakupiono w HiMedia Laboratories w Indiach.
Produkcja biosurfaktantu odbywała się w kolbach Erlenmeyera o pojemności 500 ml, zawierających 200 ml sterylnego podłoża Bushnella Haasa, uzupełnionego 1% ropą naftową jako jedynym źródłem węgla. Prekulturę Enterobacter cloacae SJ2 (1,4 × 104 CFU/ml) zaszczepiono i hodowano na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37°C, 200 obr./min przez 7 dni. Po okresie inkubacji biosurfaktant ekstrahowano poprzez wirowanie podłoża hodowlanego z prędkością 3400 × g przez 20 min w temperaturze 4°C, a uzyskany supernatant wykorzystano do badań przesiewowych. Procedury optymalizacji i charakteryzacji biosurfaktantów zapożyczono z naszych wcześniejszych badań26.
Larwy Culex quinquefasciatus pozyskano z Centrum Zaawansowanych Studiów Biologii Morskiej (CAS) w Palanchipetai w stanie Tamil Nadu (Indie). Larwy hodowano w plastikowych pojemnikach wypełnionych wodą dejonizowaną w temperaturze 27 ± 2°C i przy fotoperiodzie 12:12 (światło:ciemność). Larwy komarów karmiono 10% roztworem glukozy.
Larwy Culex quinquefasciatus znaleziono w otwartych i niezabezpieczonych szambach. Do identyfikacji i hodowli larw w laboratorium należy stosować standardowe wytyczne klasyfikacji85. Badania larwobójcze przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Światowej Organizacji Zdrowia86. SH. Larwy czwartego stadium larwalnego quinquefasciatus zebrano do zamkniętych probówek w grupach 25 ml i 50 ml z przerwą powietrzną wynoszącą dwie trzecie ich pojemności. Do każdej probówki dodano biosurfaktant (0–50 mg/ml) i przechowywano w temperaturze 25°C. W probówce kontrolnej użyto tylko wody destylowanej (50 ml). Za martwe larwy uznawano te, które nie wykazywały oznak pływania w okresie inkubacji (12–48 godzin)87. Oblicz procent śmiertelności larw, korzystając z równania. (1)88.
Rodzina Odontotermitidae obejmuje indyjskiego termita Odontotermes obesus, znalezionego w gnijących kłodach w Agricultural Campus (Uniwersytet Annamalai, Indie). Przetestuj ten biosurfaktant (0–50 mg/ml) przy użyciu standardowych procedur, aby określić, czy jest szkodliwy. Po wysuszeniu w laminarnym przepływie powietrza przez 30 minut, każdy pasek papieru Whatman został pokryty biosurfaktantem o stężeniu 30, 40 lub 50 mg/ml. Wstępnie powlekane i niepowlekane paski papieru zostały przetestowane i porównane w środku szalki Petriego. Każda szalka Petriego zawiera około trzydziestu aktywnych termitów O. obesus. Kontrolnym i testowym termitom podano wilgotny papier jako źródło pożywienia. Wszystkie płytki były przechowywane w temperaturze pokojowej przez cały okres inkubacji. Termity padły po 12, 24, 36 i 48 godzinach89,90. Następnie równanie 1 zostało użyte do oszacowania procentowej śmiertelności termitów przy różnych stężeniach biosurfaktantu. (2).
Próbki przechowywano w lodzie i pakowano w mikroprobówki zawierające 100 ml 0,1 M buforu fosforanu sodu (pH 7,4), a następnie wysyłano do Centralnego Laboratorium Patologii Akwakultury (CAPL) Centrum Akwakultury im. Rajiva Gandhiego (RGCA), Laboratorium Histologicznego, Sirkali, dystrykt Mayiladuthurai, Tamil Nadu, Indie, w celu dalszej analizy. Próbki natychmiast utrwalano w 4% paraformaldehydu w temperaturze 37°C przez 48 godzin.
Po fazie utrwalania materiał przemywano trzykrotnie 0,1 M buforem fosforanu sodu (pH 7,4), stopniowo odwadniano w etanolu i moczono w żywicy LEICA przez 7 dni. Następnie substancję umieszczano w plastikowej formie wypełnionej żywicą i polimeryzatorem, a następnie w piecu nagrzanym do 37°C, aż do całkowitej polimeryzacji bloku zawierającego substancję.
Po polimeryzacji bloczki pocięto za pomocą mikrotomu LEICA RM2235 (Rankin Biomedical Corporation 10,399 Enterprise Dr. Davisburg, MI 48,350, USA) na grubość 3 mm. Skrawki pogrupowano na szkiełkach, po sześć na szkiełko. Szkiełka wysuszono w temperaturze pokojowej, a następnie barwiono hematoksyliną przez 7 minut i przemywano bieżącą wodą przez 4 minuty. Dodatkowo, na skórę nałożono roztwór eozyny na 5 minut i przemyto bieżącą wodą przez 5 minut.
Toksyczność ostrą prognozowano na podstawie organizmów wodnych z różnych stref tropikalnych: 96-godzinnego LC50 dla ryb, 48-godzinnego LC50 dla D. magna i 96-godzinnego EC50 dla zielenic. Toksyczność biosurfaktantów ramnolipidowych dla ryb i zielenic oceniono za pomocą oprogramowania ECOSAR w wersji 2.2 dla systemu Windows, opracowanego przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (EPA). (Dostępne online pod adresem https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model).
Wszystkie testy aktywności larwicydalnej i przeciwtermitycznej przeprowadzono trzykrotnie. W celu obliczenia mediany stężenia śmiertelnego (LC50) z 95% przedziałem ufności przeprowadzono regresję nieliniową (logarytm zmiennych dawka-odpowiedź) danych dotyczących śmiertelności larw i termitów, a krzywe zależności stężenie-odpowiedź wygenerowano za pomocą oprogramowania Prism® (wersja 8.0, GraphPad Software) Inc., USA) 84, 91.
Niniejsze badanie ujawnia potencjał mikrobiologicznych biosurfaktantów wytwarzanych przez Enterobacter cloacae SJ2 jako środków larwobójczych i przeciwtermitowych przeciwko komarom. Praca ta przyczyni się do lepszego zrozumienia mechanizmów działania larwobójczego i przeciwtermitowego. Badania histologiczne larw poddanych działaniu biosurfaktantów wykazały uszkodzenia przewodu pokarmowego, jelita środkowego, kory mózgowej oraz hiperplazję komórek nabłonka jelit. Wyniki: Toksykologiczna ocena aktywności przeciwtermitowej i larwobójczej biosurfaktantu ramnolipidowego wytwarzanego przez Enterobacter cloacae SJ2 wykazała, że izolat ten jest potencjalnym biopestycydem do zwalczania chorób przenoszonych przez wektory komarów (Cx quinquefasciatus) i termitów (O. obesus). Istnieje potrzeba zrozumienia toksyczności środowiskowej biosurfaktantów i ich potencjalnego wpływu na środowisko. Niniejsze badanie stanowi naukową podstawę do oceny ryzyka środowiskowego, jakie stwarzają biosurfaktanty.
Czas publikacji: 09-04-2024