Sezonowy rozkład opadów w prowincji Guizhou jest nierównomierny, z większymi opadami wiosną i latem, ale sadzonki rzepaku są podatne na stres suszy jesienią i zimą, co poważnie wpływa na plony. Gorczyca to specjalna roślina oleista uprawiana głównie w prowincji Guizhou. Jest wysoce odporna na suszę i może być uprawiana w obszarach górskich. Jest bogatym źródłem genów odporności na suszę. Odkrycie genów odporności na suszę ma kluczowe znaczenie dla ulepszania odmian gorczycy i innowacji w zakresie zasobów genowych. Rodzina GRF odgrywa kluczową rolę we wzroście i rozwoju roślin oraz reakcji na stres suszy. Obecnie geny GRF znaleziono w Arabidopsis 2, ryżu (Oryza sativa) 12, rzepaku 13, bawełnie (Gossypium hirsutum) 14 i pszenicy (Triticum). aestivum)15, proso perłowe (Setaria italica)16 i Brassica17, ale nie ma doniesień o wykryciu genów GRF w gorczycy. W niniejszym badaniu geny rodziny GRF gorczycy zidentyfikowano na poziomie całego genomu, a następnie przeanalizowano ich właściwości fizyczne i chemiczne, powiązania ewolucyjne, homologię, motywy konserwatywne, strukturę genów, duplikacje genów, elementy cis oraz stadium siewki (faza czterech liści). Wzorce ekspresji w warunkach stresu suszy zostały kompleksowo przeanalizowane, aby zapewnić podstawy naukowe do dalszych badań nad potencjalną funkcją genów BjGRF w reakcji na suszę i dostarczyć genów kandydujących do hodowli gorczycy odpornej na suszę.
Trzydzieści cztery geny BjGRF zidentyfikowano w genomie Brassica juncea za pomocą dwóch przeszukiwań HMMER, z których wszystkie zawierają domeny QLQ i WRC. Sekwencje CDS zidentyfikowanych genów BjGRF przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej S1. Nazwy BjGRF01–BjGRF34 pochodzą z ich lokalizacji na chromosomie. Właściwości fizykochemiczne tej rodziny wskazują na dużą zmienność długości aminokwasów, od 261 aa (BjGRF19) do 905 aa (BjGRF28). Punkt izoelektryczny BjGRF waha się od 6,19 (BjGRF02) do 9,35 (BjGRF03) ze średnią wartością 8,33, a 88,24% BjGRF to białko zasadowe. Przewidywany zakres masy cząsteczkowej BjGRF wynosi od 29,82 kDa (BjGRF19) do 102,90 kDa (BjGRF28); indeks niestabilności białek BjGRF waha się od 51,13 (BjGRF08) do 78,24 (BjGRF19), wszystkie są większe niż 40, co wskazuje, że indeks kwasów tłuszczowych waha się od 43,65 (BjGRF01) do 78,78 (BjGRF22), średnia hydrofilowość (GRAVY) waha się od -1,07 (BjGRF31) do -0,45 (BjGRF22), wszystkie hydrofilowe białka BjGRF mają ujemne wartości GRAVY, co może być spowodowane brakiem hydrofobowości spowodowanym przez reszty. Przewidywania dotyczące lokalizacji subkomórkowej wykazały, że 31 białek kodowanych przez BjGRF można zlokalizować w jądrze komórkowym, BjGRF04 można zlokalizować w peroksysomach, BjGRF25 można zlokalizować w cytoplazmie, a BjGRF28 można zlokalizować w chloroplastach (Tabela 1), co wskazuje na to, że BjGRF mogą być zlokalizowane w jądrze komórkowym i odgrywać ważną rolę regulacyjną jako czynniki transkrypcyjne.
Analiza filogenetyczna rodzin GRF u różnych gatunków może pomóc w badaniu funkcji genów. Dlatego pobrano sekwencje aminokwasowe pełnej długości 35 GRF rzepaku, 16 rzepy, 12 ryżu, 10 prosa i 9 Arabidopsis, a następnie skonstruowano drzewo filogenetyczne na podstawie 34 zidentyfikowanych genów BjGRF (ryc. 1). Trzy podrodziny zawierają różną liczbę członków; 116 GRF TF dzieli się na trzy różne podrodziny (grupy A–C), zawierające odpowiednio 59 (50,86%), 34 (29,31%) i 23 (19,83)% GRF. Spośród nich 34 członków rodziny BjGRF jest rozproszonych w 3 podrodzinach: 13 członków w grupie A (38,24%), 12 członków w grupie B (35,29%) i 9 członków w grupie C (26,47%). W procesie poliploidyzacji musztardowej liczba genów BjGRF w różnych podrodzinach jest różna, co może prowadzić do amplifikacji i utraty genów. Warto zauważyć, że w grupie C nie ma rozmieszczenia GRF ryżu i prosa, podczas gdy w grupie B występują 2 GRF ryżu i 1 GRF prosa, a większość GRF ryżu i prosa jest zgrupowana w jednej gałęzi, co wskazuje na bliskie pokrewieństwo BjGRF z roślinami dwuliściennymi. Spośród nich najbardziej szczegółowe badania nad funkcją GRF u Arabidopsis thaliana stanowią podstawę do badań funkcjonalnych BjGRF.
Drzewo filogenetyczne roślin gorczycowych, w tym Brassica napus, Brassica napus, ryż, proso i członkowie rodziny Arabidopsis thaliana GRF.
Analiza genów powtarzalnych w rodzinie GRF musztardowej. Szara linia w tle przedstawia zsynchronizowany blok w genomie musztardowym, czerwona linia przedstawia parę segmentowanych powtórzeń genu BjGRF;
Ekspresja genu BjGRF w warunkach stresu suszy w fazie czwartego liścia. Dane qRT-PCR przedstawiono w tabeli uzupełniającej S5. Istotne różnice w danych oznaczono małymi literami.
W miarę ciągłych zmian klimatu globalnego, badanie sposobów radzenia sobie upraw ze stresem suszy i doskonalenia mechanizmów ich tolerancji stało się gorącym tematem badań18. Po suszy struktura morfologiczna, ekspresja genów i procesy metaboliczne roślin ulegają zmianom, co może prowadzić do zahamowania fotosyntezy i zaburzeń metabolicznych, wpływając na plony i jakość upraw19,20,21. Kiedy rośliny wyczuwają sygnały suszy, wytwarzają wtórne przekaźniki, takie jak Ca2+ i fosfatydyloinozytol, zwiększają wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapnia i aktywują sieć regulacyjną szlaku fosforylacji białek22,23. Ostateczne białko docelowe jest bezpośrednio zaangażowane w obronę komórkową lub reguluje ekspresję powiązanych genów stresu poprzez czynniki transkrypcyjne (TF), zwiększając tolerancję roślin na stres24,25. Zatem czynniki transkrypcyjne (TF) odgrywają kluczową rolę w reagowaniu na stres suszy. Na podstawie sekwencji i właściwości wiązania DNA czynników transkrypcyjnych reagujących na stres suszy, można je podzielić na różne rodziny, takie jak GRF, ERF, MYB, WRKY i inne rodziny26.
Rodzina genów GRF to rodzaj specyficznego dla roślin czynnika transkrypcyjnego (TF), który odgrywa ważną rolę w różnych aspektach, takich jak wzrost, rozwój, transdukcja sygnału i reakcje obronne roślin27. Od czasu zidentyfikowania pierwszego genu GRF u O. sativa28, coraz więcej genów GRF zostało zidentyfikowanych u wielu gatunków i wykazano, że wpływają one na wzrost, rozwój i reakcję roślin na stres8, 29, 30,31,32. Wraz z opublikowaniem sekwencji genomu Brassica juncea, identyfikacja rodziny genów BjGRF stała się możliwa33. W tym badaniu zidentyfikowano 34 geny BjGRF w całym genomie gorczycy i nazwano je BjGRF01–BjGRF34 na podstawie ich pozycji chromosomowej. Wszystkie z nich zawierają wysoce konserwatywne domeny QLQ i WRC. Analiza właściwości fizykochemicznych wykazała, że różnice w liczbie aminokwasów i masie cząsteczkowej białek BjGRF (z wyjątkiem BjGRF28) nie były istotne, co wskazuje, że członkowie rodziny BjGRF mogą pełnić podobne funkcje. Analiza struktury genu wykazała, że 64,7% genów BjGRF zawierało 4 eksony, co wskazuje, że struktura genu BjGRF jest stosunkowo konserwatywna w procesie ewolucji, ale liczba eksonów w genach BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 i BjGRF29 jest większa. Badania wykazały, że dodanie lub usunięcie eksonów lub intronów może prowadzić do różnic w strukturze i funkcji genu, a tym samym do powstania nowych genów34,35,36. Dlatego też spekulujemy, że intron BjGRF został utracony w procesie ewolucji, co może powodować zmiany w funkcji genu. Zgodnie z istniejącymi badaniami, odkryliśmy również, że liczba intronów była związana z ekspresją genu. Gdy liczba intronów w genie jest duża, gen może szybko reagować na różne niekorzystne czynniki.
Duplikacja genów jest głównym czynnikiem ewolucji genomicznej i genetycznej37. Powiązane badania wykazały, że duplikacja genów nie tylko zwiększa liczbę genów GRF, ale także służy jako sposób generowania nowych genów, które pomagają roślinom przystosować się do różnych niekorzystnych warunków środowiskowych38. W badaniu tym znaleziono łącznie 48 zduplikowanych par genów, z których wszystkie były duplikacjami segmentowymi, co wskazuje, że duplikacje segmentowe są głównym mechanizmem zwiększania liczby genów w tej rodzinie. W literaturze opisano, że duplikacja segmentowa może skutecznie promować amplifikację członków rodziny genów GRF u Arabidopsis i truskawek, a nie stwierdzono tandemowej duplikacji tej rodziny genów u żadnego z gatunków27,39. Wyniki tego badania są zgodne z istniejącymi badaniami nad Arabidopsis thaliana i rodzinami truskawek, sugerując, że rodzina GRF może zwiększać liczbę genów i generować nowe geny poprzez duplikację segmentową u różnych roślin.
W tym badaniu zidentyfikowano łącznie 34 geny BjGRF w gorczycy, które podzielono na 3 podrodziny. Geny te wykazywały podobne konserwatywne motywy i struktury genów. Analiza kolinearności ujawniła 48 par duplikacji segmentów w gorczycy. Region promotorowy BjGRF zawiera elementy cis-działające związane z odpowiedzią na światło, odpowiedzią hormonalną, odpowiedzią na stres środowiskowy oraz wzrostem i rozwojem. Ekspresję 34 genów BjGRF wykryto na etapie siewki gorczycy (korzenie, łodygi, liście), a wzór ekspresji 10 genów BjGRF w warunkach suszy. Stwierdzono, że wzory ekspresji genów BjGRF w warunkach stresu suszy były podobne i mogą być podobne. udział w regulacji wymuszania suszy. Geny BjGRF03 i BjGRF32 mogą odgrywać pozytywną rolę regulacyjną w stresie suszy, podczas gdy BjGRF06 i BjGRF23 odgrywają rolę w stresie suszy jako geny docelowe miR396. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badanie dostarcza biologicznych podstaw do przyszłego odkrycia funkcji genu BjGRF w roślinach Brassicaceae.
Nasiona gorczycy użyte w tym eksperymencie zostały dostarczone przez Instytut Badań nad Nasionami Oleistymi w Guizhou, Akademię Nauk Rolniczych w Guizhou. Wyselekcjonowano całe nasiona i posadzono je w glebie (substrat:gleba = 3:1), a następnie zebrano korzenie, łodygi i liście po fazie czterech liści. Rośliny poddano działaniu 20% PEG 6000 w celu symulacji suszy, a liście zebrano po 0, 3, 6, 12 i 24 godzinach. Wszystkie próbki roślin natychmiast zamrożono w ciekłym azocie, a następnie przechowywano w zamrażarce w temperaturze -80°C do następnego testu.
Wszystkie dane uzyskane lub przeanalizowane w trakcie badania zawarto w opublikowanym artykule oraz w plikach z informacjami uzupełniającymi.
Czas publikacji: 22-01-2025