Sezonowy rozkład opadów w prowincji Guizhou jest nierównomierny, z większymi opadami wiosną i latem, ale sadzonki rzepaku są podatne na stres suszy jesienią i zimą, co poważnie wpływa na plony. Gorczyca to specjalna roślina oleista uprawiana głównie w prowincji Guizhou. Ma silną tolerancję na suszę i może być uprawiana w obszarach górskich. Jest bogatym źródłem genów odpornych na suszę. Odkrycie genów odpornych na suszę ma kluczowe znaczenie dla ulepszania odmian gorczycy i innowacji w zasobach plazmy zarodkowej. Rodzina GRF odgrywa kluczową rolę we wzroście i rozwoju roślin oraz w reakcji na stres suszy. Obecnie geny GRF znaleziono w Arabidopsis 2, ryżu (Oryza sativa) 12, rzepaku 13, bawełnie (Gossypium hirsutum) 14, pszenicy (Triticum). aestivum)15, proso perłowe (Setaria italica)16 i Brassica17, ale nie ma doniesień o wykryciu genów GRF w musztardzie. W tym badaniu geny rodziny GRF musztardy zostały zidentyfikowane na poziomie całego genomu, a ich cechy fizyczne i chemiczne, powiązania ewolucyjne, homologia, konserwatywne motywy, struktura genów, duplikacje genów, elementy cis i stadium siewki (etap czterech liści) zostały przeanalizowane. Wzory ekspresji w stresie suszy zostały kompleksowo przeanalizowane, aby zapewnić naukową podstawę do dalszych badań nad potencjalną funkcją genów BjGRF w reakcji na suszę i dostarczyć genów kandydujących do hodowli musztardy odpornej na suszę.
Trzydzieści cztery geny BjGRF zidentyfikowano w genomie Brassica juncea przy użyciu dwóch przeszukiwań HMMER, z których wszystkie zawierają domeny QLQ i WRC. Sekwencje CDS zidentyfikowanych genów BjGRF przedstawiono w Tabeli uzupełniającej S1. BjGRF01–BjGRF34 są nazwane na podstawie ich lokalizacji na chromosomie. Właściwości fizykochemiczne tej rodziny wskazują, że długość aminokwasów jest bardzo zmienna i waha się od 261 aa (BjGRF19) do 905 aa (BjGRF28). Punkt izoelektryczny BjGRF waha się od 6,19 (BjGRF02) do 9,35 (BjGRF03) ze średnią 8,33, a 88,24% BjGRF jest białkiem zasadowym. Przewidywany zakres masy cząsteczkowej BjGRF wynosi od 29,82 kDa (BjGRF19) do 102,90 kDa (BjGRF28); indeks niestabilności białek BjGRF wynosi od 51,13 (BjGRF08) do 78,24 (BjGRF19), wszystkie są większe niż 40, co wskazuje, że indeks kwasów tłuszczowych wynosi od 43,65 (BjGRF01) do 78,78 (BjGRF22), średnia hydrofilowość (GRAVY) wynosi od -1,07 (BjGRF31) do -0,45 (BjGRF22), wszystkie hydrofilowe białka BjGRF mają ujemne wartości GRAVY, co może wynikać z braku hydrofobowości spowodowanej przez reszty. Przewidywanie lokalizacji subkomórkowej wykazało, że 31 białek kodowanych przez BjGRF może być zlokalizowanych w jądrze, BjGRF04 może być zlokalizowane w peroksysomach, BjGRF25 może być zlokalizowane w cytoplazmie, a BjGRF28 może być zlokalizowane w chloroplastach (Tabela 1), co wskazuje, że BjGRF mogą być zlokalizowane w jądrze i odgrywać ważną rolę regulacyjną jako czynniki transkrypcyjne.
Analiza filogenetyczna rodzin GRF u różnych gatunków może pomóc w badaniu funkcji genów. Dlatego też pobrano sekwencje aminokwasów pełnej długości 35 GRF rzepaku, 16 rzepy, 12 ryżu, 10 prosa i 9 Arabidopsis, a drzewo filogenetyczne skonstruowano na podstawie 34 zidentyfikowanych genów BjGRF (rys. 1). Trzy podrodziny zawierają różną liczbę członków; 116 TF GRF jest podzielonych na trzy różne podrodziny (grupy A~C), zawierające odpowiednio 59 (50,86%), 34 (29,31%) i 23 (19,83)% GRF. Spośród nich 34 członków rodziny BjGRF jest rozproszonych w 3 podrodzinach: 13 członków w grupie A (38,24%), 12 członków w grupie B (35,29%) i 9 członków w grupie C (26,47%). W procesie poliploidyzacji musztardowej liczba genów BjGRF w różnych podrodzinach jest różna, a amplifikacja i utrata genów mogły wystąpić. Warto zauważyć, że w grupie C nie ma dystrybucji GRF ryżu i prosa, podczas gdy w grupie B są 2 GRF ryżu i 1 GRF prosa, a większość GRF ryżu i prosa jest zgrupowana w jednej gałęzi, co wskazuje, że BjGRF są blisko spokrewnione z roślinami dwuliściennymi. Spośród nich najbardziej dogłębne badania funkcji GRF w Arabidopsis thaliana stanowią podstawę do badań funkcjonalnych BjGRF.
Drzewo filogenetyczne roślin gorczycowych, w tym Brassica napus, Brassica napus, ryż, proso i członkowie rodziny Arabidopsis thaliana GRF.
Analiza genów powtarzalnych w rodzinie musztardowej GRF. Szara linia w tle przedstawia zsynchronizowany blok w genomie musztardowym, czerwona linia przedstawia parę segmentowanych powtórzeń genu BjGRF;
Ekspresja genu BjGRF w warunkach stresu suszy w fazie czwartego liścia. Dane qRT-PCR przedstawiono w tabeli uzupełniającej S5. Istotne różnice w danych oznaczono małymi literami.
W miarę jak globalny klimat ulega ciągłym zmianom, badanie tego, jak uprawy radzą sobie ze stresem suszy i ulepszanie mechanizmów ich tolerancji, stało się gorącym tematem badawczym18. Po suszy struktura morfologiczna, ekspresja genów i procesy metaboliczne roślin ulegną zmianie, co może prowadzić do zaprzestania fotosyntezy i zaburzeń metabolicznych, co wpłynie na plony i jakość upraw19,20,21. Kiedy rośliny wyczuwają sygnały suszy, wytwarzają drugie przekaźniki, takie jak Ca2+ i fosfatydyloinozytol, zwiększają wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapnia i aktywują sieć regulacyjną szlaku fosforylacji białek22,23. Ostateczne białko docelowe jest bezpośrednio zaangażowane w obronę komórkową lub reguluje ekspresję powiązanych genów stresu poprzez czynniki transkrypcyjne (TF), zwiększając tolerancję roślin na stres24,25. Zatem czynniki transkrypcyjne (TF) odgrywają kluczową rolę w reagowaniu na stres suszy. Na podstawie sekwencji i właściwości wiązania DNA czynników transkrypcyjnych reagujących na stres suszy, czynniki transkrypcyjne można podzielić na różne rodziny, takie jak GRF, ERF, MYB, WRKY i inne rodziny26.
Rodzina genów GRF to rodzaj specyficznego dla roślin czynnika transkrypcyjnego, który odgrywa ważną rolę w różnych aspektach, takich jak wzrost, rozwój, przekazywanie sygnałów i reakcje obronne roślin27. Od czasu zidentyfikowania pierwszego genu GRF u O. sativa28, coraz więcej genów GRF zostało zidentyfikowanych u wielu gatunków i wykazano, że wpływają one na wzrost, rozwój i reakcję roślin na stres8, 29, 30,31,32. Wraz z opublikowaniem sekwencji genomu Brassica juncea, identyfikacja rodziny genów BjGRF stała się możliwa33. W tym badaniu zidentyfikowano 34 geny BjGRF w całym genomie musztardowym i nazwano je BjGRF01–BjGRF34 na podstawie ich położenia chromosomowego. Wszystkie z nich zawierają wysoce konserwatywne domeny QLQ i WRC. Analiza właściwości fizykochemicznych wykazała, że różnice w liczbie aminokwasów i masie cząsteczkowej białek BjGRF (z wyjątkiem BjGRF28) nie były istotne, co wskazuje, że członkowie rodziny BjGRF mogą mieć podobne funkcje. Analiza struktury genu wykazała, że 64,7% genów BjGRF zawierało 4 eksony, co wskazuje, że struktura genu BjGRF jest stosunkowo zachowana w ewolucji, ale liczba eksonów w genach BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 i BjGRF29 jest większa. Badania wykazały, że dodanie lub usunięcie eksonów lub intronów może prowadzić do różnic w strukturze i funkcji genu, tworząc w ten sposób nowe geny34,35,36. Dlatego też spekulujemy, że intron BjGRF został utracony w trakcie ewolucji, co może powodować zmiany w funkcji genu. Zgodnie z istniejącymi badaniami odkryliśmy również, że liczba intronów była związana z ekspresją genu. Gdy liczba intronów w genie jest duża, gen może szybko reagować na różne niekorzystne czynniki.
Duplikacja genów jest głównym czynnikiem ewolucji genomicznej i genetycznej37. Powiązane badania wykazały, że duplikacja genów nie tylko zwiększa liczbę genów GRF, ale także służy jako sposób generowania nowych genów, aby pomóc roślinom dostosować się do różnych niekorzystnych warunków środowiskowych38. W tym badaniu znaleziono łącznie 48 zduplikowanych par genów, z których wszystkie były duplikacjami segmentowymi, co wskazuje, że duplikacje segmentowe są głównym mechanizmem zwiększania liczby genów w tej rodzinie. W literaturze opisano, że duplikacja segmentowa może skutecznie promować amplifikację członków rodziny genów GRF u Arabidopsis i truskawek, a nie stwierdzono żadnej tandemowej duplikacji tej rodziny genów u żadnego z gatunków27,39. Wyniki tego badania są zgodne z istniejącymi badaniami nad Arabidopsis thaliana i rodzinami truskawek, co sugeruje, że rodzina GRF może zwiększać liczbę genów i generować nowe geny poprzez duplikację segmentową w różnych roślinach.
W tym badaniu zidentyfikowano łącznie 34 geny BjGRF w musztardzie, które podzielono na 3 podrodziny. Geny te wykazywały podobne konserwatywne motywy i struktury genów. Analiza kolinearności ujawniła 48 par duplikacji segmentów w musztardzie. Region promotora BjGRF zawiera elementy cis-działające związane z odpowiedzią na światło, odpowiedzią hormonalną, odpowiedzią na stres środowiskowy oraz wzrostem i rozwojem. Ekspresję 34 genów BjGRF wykryto na etapie siewki musztardy (korzenie, łodygi, liście), a wzór ekspresji 10 genów BjGRF w warunkach suszy. Stwierdzono, że wzory ekspresji genów BjGRF w warunkach stresu suszy były podobne i mogą być podobne. udział w regulacji wymuszającej suszę. Geny BjGRF03 i BjGRF32 mogą odgrywać pozytywne role regulacyjne w stresie suszy, podczas gdy BjGRF06 i BjGRF23 odgrywają role w stresie suszy jako geny docelowe miR396. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badanie dostarcza biologicznych podstaw do przyszłych odkryć dotyczących funkcji genu BjGRF w roślinach Brassicaceae.
Nasiona gorczycy użyte w tym eksperymencie zostały dostarczone przez Guizhou Oil Seed Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences. Wybierz całe nasiona i posadź je w glebie (substrat: gleba = 3:1), a następnie zbierz korzenie, łodygi i liście po stadium czterech liści. Rośliny traktowano 20% PEG 6000, aby symulować suszę, a liście zbierano po 0, 3, 6, 12 i 24 godzinach. Wszystkie próbki roślin natychmiast zamrożono w ciekłym azocie, a następnie przechowywano w zamrażarce w temperaturze -80°C do następnego testu.
Wszystkie dane uzyskane lub przeanalizowane w trakcie badania zawarto w opublikowanym artykule oraz w plikach z informacjami uzupełniającymi.
Czas publikacji: 22-01-2025