Materiały roślinne i patogenne
Mapa asocjacji sorgo, znana jako populacja konwersji sorgo (SCP), została dostarczona przez dr Pata Browna z Uniwersytetu Illinois (obecnie UC Davis).Zostało to opisane wcześniej i stanowi zbiór różnorodnych linii przekształconych w sposób zapewniający niewrażliwość na światło i mniejszy wzrost, aby ułatwić wzrost i rozwój roślin w środowiskach amerykańskich.W tym badaniu wykorzystano 510 linii z tej populacji, chociaż ze względu na złe kiełkowanie i inne problemy z kontrolą jakości, nie wszystkie linie zostały wykorzystane w analizie wszystkich trzech cech.Ostatecznie do analizy odpowiedzi na chitynę wykorzystano dane z 345 linii, 472 linii do analizy odpowiedzi flg22 i 456 linii do analizy oporności na TLS.B. Cookeiszczep LSLP18 otrzymano od dr Burta Bluhma z Uniwersytetu Arkansas.
Pomiar odpowiedzi MAMP
W tym badaniu zastosowano dwa różne MAMP flg22 (katalog Genscript nr RP19986) i chitynę.Rośliny sorgo hodowano we wkładkach ułożonych na równinach wypełnionych ziemią (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) w szklarni.Rośliny podlewano dzień przed pobraniem próbek, aby uniknąć dodatkowego zawilgocenia liści w dniu zbioru.
Linie losowano i ze względów logistycznych zasadzono w partiach po 60 linii.W każdej linii zasadzono trzy „doniczki” z dwoma nasionami w każdej linii.Kolejne partie sadzono zaraz po przetworzeniu poprzedniej partii, aż do oceny całej populacji.Przeprowadzono dwie serie eksperymentalne dla obu MAMP z genotypami ponownie randomizowanymi w każdej z dwóch serii.
Testy ROS przeprowadzono jak opisano wcześniej.W skrócie, dla każdej linii posadzono sześć nasion w 3 różnych doniczkach.Z powstałych sadzonek wybrano trzy w oparciu o jednorodność.Nie stosowano sadzonek, które wyglądały nietypowo lub były znacznie wyższe lub krótsze niż większość.Z najszerszej części 4. liścia trzech różnych 15-dniowych roślin sorgo wycięto cztery krążki liściowe o średnicy 3 mm.Jeden krążek na liść w przypadku dwóch roślin i dwa krążki w przypadku jednej rośliny, przy czym drugi krążek służy do kontroli wody (patrz poniżej).Krążki indywidualnie pływano na 50 µl H20 w czarnej 96-studzienkowej płytce, zamknięto aluminiową uszczelką, aby uniknąć ekspozycji na światło, i trzymano w temperaturze pokojowej przez noc.Następnego ranka przygotowano roztwór reakcyjny, stosując sondę chemiluminescencyjną L-012 o stężeniu 2 mg/ml (Wako, nr katalogowy 120-04891), peroksydazę chrzanową o stężeniu 2 mg/ml (typ VI-A, Sigma-Aldrich, nr katalogowy P6782) i 100 mg/ml chityny lub 2 µM Flg22.Do trzech z czterech dołków dodano 50 µl tego roztworu reakcyjnego.Czwarty dołek stanowił próbną kontrolę, do której dodano roztwór reakcyjny bez MAMP.Na każdej płytce znajdowały się także cztery ślepe studzienki zawierające wyłącznie wodę.
Po dodaniu roztworu reakcyjnego mierzono luminescencję za pomocą wielodetekcyjnego czytnika mikropłytek SynergyTM 2 (BioTek) co 2 minuty przez 1 godzinę.Czytnik płytek dokonuje pomiarów luminescencji co 2 minuty w ciągu tej 1 godziny.Obliczono sumę wszystkich 31 odczytów, aby uzyskać wartość dla każdego dołka.Oszacowaną wartość odpowiedzi MAMP dla każdego genotypu obliczono jako (średnia wartość luminescencji z trzech dołków doświadczalnych – wartość próbnego dołka) minus średnia wartość ślepego dołka.Wartości pustych dołków były stale bliskie zeru.
Krążki liścioweNicotiana benthamiana, jedną linię sorgo o wysokiej wrażliwości (SC0003) i jedną linię sorgo o niskiej wrażliwości (PI 6069) włączono także jako kontrole do każdej 96-studzienkowej płytki w celach kontroli jakości.
B. Cookeiprzygotowanie inokulum i zaszczepienie
B. Cookeiinokulum przygotowano jak opisano wcześniej.W skrócie, ziarna sorgo moczono w wodzie przez trzy dni, płuczono, zgarniano do 1-litrowych kolb stożkowych i poddawano autoklawowaniu przez godzinę w temperaturze 15 psi i 121°C.Następnie ziarna zaszczepiono około 5 ml zmacerowanej grzybni ze świeżej kulturyB. CookeiWyizolowano LSLP18 i pozostawiono na 2 tygodnie w temperaturze pokojowej, wstrząsając kolbami co 3 dni.Po 2 tygodniach zakażone grzybem ziarna sorgo suszono na powietrzu, a następnie przechowywano w temperaturze 4°C do czasu zaszczepienia pola.Przez całe doświadczenie stosowano to samo inokulum, które co roku było świeże.Do inokulacji umieszczano 6–10 porażonych ziaren w okółku 4–5 tygodniowych roślin sorgo.Zarodniki wytworzone przez te grzyby zapoczątkowały infekcję młodych roślin sorgo w ciągu tygodnia.
Przygotowanie nasion
Przed wysiewem w polu nasiona sorgo zaprawiano mieszaniną grzybobójczą, owadobójczą i sejfnerem zawierającą ~ 1% grzybobójczego Spirato 480 FS, 4% grzybobójczego Sebring 480 FS, 3% środka zabezpieczającego nasiona Sorpro 940 ES.Następnie nasiona suszono na powietrzu przez 3 dni, co spowodowało cienką powłokę tej mieszanki wokół nasion.Sejfner pozwolił na zastosowanie herbicydu Dual Magnum w leczeniu przedwschodowym.
Ocena odporności na plamistość liści docelowych
SCP zasadzono w Central Crops Research Station w Clayton, Karolina Północna, w dniach 14–15 czerwca 2017 r. i 20 czerwca 2018 r. w układzie losowych kompletnych bloków, w każdym przypadku z dwoma replikacjami eksperymentalnymi.Doświadczenia prowadzono w pojedynczych rzędach o długości 1,8 m i szerokości rzędów 0,9 m, stosując 10 nasion na poletku.Na obrzeżach każdego doświadczenia posadzono dwa rzędy graniczne, aby zapobiec efektom krawędziowym.Do eksperymentów inokulowano 20 lipca 2017 r. i 20 lipca 2018 r., kiedy to rośliny sorgo znajdowały się w 3. stadium wzrostu. Oceny dokonywano w skali od jednej do dziewięciu, gdzie rośliny nie wykazujące żadnych oznak choroby oceniano na 9 i całkowicie martwe rośliny oceniano jako jeden.W 2017 r. przeprowadzono dwie oceny, a w 2018 r. cztery odczyty, rozpoczynając każdego roku dwa tygodnie po zaszczepieniu.sAUDPC (standaryzowany obszar pod krzywą postępu choroby) obliczono w sposób opisany wcześniej.
Czas publikacji: 01 kwietnia 2021 r