Materiały roślinne i patogenne
Populację mapującą asocjację sorgo, znaną jako populacja konwersji sorgo (SCP), dostarczył dr Pat Brown z University of Illinois (obecnie UC Davis). Została ona opisana wcześniej i jest zbiorem różnych linii przekształconych na niewrażliwość na fotoperiod i mniejszy wzrost, aby ułatwić wzrost i rozwój roślin w środowiskach USA. W tym badaniu wykorzystano 510 linii z tej populacji, chociaż z powodu złego kiełkowania i innych problemów z kontrolą jakości nie wszystkie linie zostały wykorzystane w analizie wszystkich trzech cech. Ostatecznie dane z 345 linii wykorzystano do analizy odpowiedzi chitynowej, 472 linii do odpowiedzi flg22 i 456 do odporności na TLS.B. ciasteczkoszczep LSLP18 otrzymano od dr Burta Bluhma z Uniwersytetu w Arkansas.
Pomiar odpowiedzi MAMP
W tym badaniu zastosowano dwa różne MAMP flg22 (katalog Genscript nr RP19986) i chitynę. Rośliny sorgo uprawiano we wkładkach położonych na płaskich podłożach wypełnionych glebą (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) w szklarni. Rośliny podlewano dzień przed pobraniem próbek, aby uniknąć dodatkowej wilgoci liści w dniu pobrania.
Linie zostały zrandomizowane i ze względów logistycznych zostały zasadzone w partiach po 60 linii. Dla każdej linii posadzono trzy „doniczki” z dwoma nasionami na linię. Kolejne partie zostały zasadzone natychmiast po przetworzeniu poprzedniej partii, aż do momentu oceny całej populacji. Przeprowadzono dwa przebiegi eksperymentalne dla obu MAMP z genotypami ponownie zrandomizowanymi w każdym z dwóch przebiegów.
Testy ROS przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem. Krótko mówiąc, dla każdej linii posadzono sześć nasion w 3 różnych doniczkach. Z powstałych sadzonek wybrano trzy na podstawie jednolitości. Sadzonki, które wyglądały nietypowo lub były znacznie wyższe lub niższe od większości, nie zostały użyte. Czterolistne krążki o średnicy 3 mm wycięto z najszerszej części 4. liścia trzech różnych 15-dniowych roślin sorgo. Jeden krążek na liść z dwóch roślin i dwa krążki z jednej rośliny, przy czym drugi krążek stał się kontrolą wodną (patrz poniżej). Krążki pojedynczo pływały na 50 µl H2O w czarnej 96-dołkowej płytce, uszczelniono aluminiową uszczelką, aby uniknąć narażenia na światło, i przechowywano w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego ranka przygotowano roztwór reakcyjny przy użyciu 2 mg/ml sondy chemiluminescencyjnej L-012 (Wako, nr katalogowy 120-04891), 2 mg/ml peroksydazy chrzanowej (typ VI-A, Sigma-Aldrich, nr katalogowy P6782) i 100 mg/ml chityny lub 2 μM Flg22. 50 µl tego roztworu reakcyjnego dodano do trzech z czterech dołków. Czwarty dołek był próbą kontrolną, do której dodano roztwór reakcyjny z wyłączeniem MAMP. W każdej płytce uwzględniono również cztery puste dołki zawierające tylko wodę.
Po dodaniu roztworu reakcyjnego luminescencję mierzono za pomocą czytnika mikropłytek wielodetekcyjnych SynergyTM 2 (BioTek) co 2 minuty przez 1 godzinę. Czytnik płytek wykonuje pomiary luminescencji co 2 minuty w ciągu tej 1 godziny. Suma wszystkich 31 odczytów została obliczona w celu uzyskania wartości dla każdego dołka. Szacunkowa wartość odpowiedzi MAMP dla każdego genotypu została obliczona jako (średnia wartość luminescencji trzech dołków eksperymentalnych — wartość dołka pozorowanego) - minus średnia wartość dołka pustego. Wartości dołka pustego były stale bliskie zeru.
Krążki liścioweNicotiana benthamianaW celu kontroli jakości w każdej płytce 96-dołkowej umieszczono również jedną linię sorgo o wysokiej reakcji (SC0003) i jedną linię sorgo o niskiej reakcji (PI 6069) jako kontrole.
B. ciasteczkoprzygotowanie szczepionki i szczepienie
B. ciasteczkoinokulum przygotowano w sposób opisany wcześniej. W skrócie, ziarna sorgo moczono w wodzie przez trzy dni, płukano, nabierano do 1-litrowych kolb stożkowych i autoklawowano przez godzinę przy ciśnieniu 15 psi i temperaturze 121 °C. Następnie ziarna zaszczepiono około 5 ml zmacerowanej grzybni ze świeżej kulturyB. ciasteczkoIzolaty LSLP18 pozostawiono na 2 tygodnie w temperaturze pokojowej, wstrząsając kolbami co 3 dni. Po 2 tygodniach zainfekowane grzybem ziarna sorgo wysuszono na powietrzu, a następnie przechowywano w temperaturze 4 °C do momentu inokulacji polowej. To samo inokulum użyto do całego badania i przygotowywano na nowo każdego roku. Do inokulacji 6–10 zainfekowanych ziaren umieszczono w okółku 4–5-tygodniowych roślin sorgo. Zarodniki wytwarzane przez te grzyby zainicjowały infekcję młodych roślin sorgo w ciągu tygodnia.
Przygotowanie nasion
Przed posadzeniem na polu nasiona sorgo zostały potraktowane mieszanką fungicydu, insektycydu i safenera zawierającą ~ 1% fungicydu Spirato 480 FS, 4% fungicydu Sebring 480 FS, 3% safenera nasion Sorpro 940 ES. Następnie nasiona suszono na powietrzu przez 3 dni, co zapewniło cienką powłokę tej mieszanki wokół nasion. Safener pozwolił na zastosowanie herbicydu Dual Magnum jako zabiegu przedwschodowego.
Ocena odporności na plamistość liści
SCP posadzono w Central Crops Research Station w Clayton, NC w dniach 14–15 czerwca 2017 r. i 20 czerwca 2018 r. w losowym układzie bloków kompletnych z dwoma powtórzeniami eksperymentalnymi w każdym przypadku. Eksperymenty przeprowadzono w pojedynczych rzędach 1,8 m z szerokością rzędu 0,9 m, używając 10 nasion na działkę. Dwa rzędy graniczne posadzono wokół obwodu każdego eksperymentu, aby zapobiec efektom krawędziowym. Eksperymenty zaszczepiono 20 lipca 2017 r. i 20 lipca 2018 r., w którym to momencie rośliny sorgo znajdowały się w 3. fazie wzrostu. Oceny dokonywano w skali od jednego do dziewięciu, gdzie rośliny nie wykazujące oznak choroby były oceniane jako dziewięć, a całkowicie martwe rośliny były oceniane jako jeden. Dwie oceny dokonano w 2017 r., a cztery odczyty w 2018 r., zaczynając dwa tygodnie po zaszczepieniu każdego roku. sAUDPC (standaryzowane pole pod krzywą postępu choroby) obliczono w sposób opisany wcześniej.
Czas publikacji: 01-kwi-2021