Materiały roślinne i patogenne
Populację mapującą asocjacje sorgo, znaną jako populacja konwersji sorgo (SCP), dostarczył dr Pat Brown z Uniwersytetu Illinois (obecnie UC Davis). Została ona już wcześniej opisana i stanowi zbiór zróżnicowanych linii przekształconych w niewrażliwość na fotoperiod i mniejszy wzrost, aby ułatwić wzrost i rozwój roślin w warunkach amerykańskich. W badaniu wykorzystano 510 linii z tej populacji, jednak ze względu na słabe kiełkowanie i inne problemy z kontrolą jakości, nie wszystkie linie zostały wykorzystane w analizie wszystkich trzech cech. Ostatecznie dane z 345 linii wykorzystano do analizy odpowiedzi chitynowej, 472 linii do odpowiedzi flg22 i 456 do analizy odporności na TLS.B. cookieiszczep LSLP18 otrzymano od dr. Burta Bluhma z Uniwersytetu Arkansas.
Pomiar odpowiedzi MAMP
W badaniu wykorzystano dwa różne MAMP-y: flg22 (nr katalogowy Genscript RP19986) oraz chitynę. Rośliny sorgo uprawiano we wkładkach umieszczonych na płaskich podłożach wypełnionych glebą (33% mieszanki Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) w szklarni. Rośliny podlewano dzień przed pobraniem próbek, aby uniknąć nadmiernej wilgoci liści w dniu pobrania.
Linie zostały zrandomizowane i, ze względów logistycznych, posadzono je partiami po 60 linii. Dla każdej linii posadzono trzy „doniczki” z dwoma nasionami na linię. Kolejne partie wysiewano zaraz po przetworzeniu poprzedniej partii, aż do momentu oceny całej populacji. Przeprowadzono dwa cykle eksperymentalne dla obu MAMP, z genotypami ponownie zrandomizowanymi w każdym z dwóch cykli.
Testy ROS przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem. W skrócie, dla każdej linii posadzono sześć nasion w 3 różnych doniczkach. Z otrzymanych sadzonek wybrano trzy, biorąc pod uwagę ich jednolitość. Sadzonki, które wyglądały nietypowo lub były znacznie wyższe lub niższe od większości, nie zostały użyte. Z najszerszej części czwartego liścia trzech różnych 15-dniowych roślin sorgo wycięto krążki z czterema liśćmi o średnicy 3 mm. Po jednym krążku na liść z dwóch roślin i dwa krążki z jednej rośliny, przy czym drugi krążek stanowił kontrolę wodną (patrz poniżej). Krążki umieszczono indywidualnie na 50 µl H2O w czarnej płytce 96-dołkowej, uszczelniono aluminiową plombą, aby zapobiec ekspozycji na światło, i przechowywano w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego ranka przygotowano roztwór reakcyjny z użyciem sondy chemiluminescencyjnej L-012 (Wako, nr katalogowy 120-04891) o stężeniu 2 mg/ml, peroksydazy chrzanowej (typ VI-A, Sigma-Aldrich, nr katalogowy P6782) o stężeniu 2 mg/ml oraz chityny (typ VI-A, Sigma-Aldrich, nr katalogowy P6782) o stężeniu 100 mg/ml lub 2 μM Flg22. 50 µl tego roztworu reakcyjnego dodano do trzech z czterech dołków. Czwarty dołek stanowił próbę kontrolną, do której dodano roztwór reakcyjny bez MAMP. W każdej płytce znajdowały się również cztery dołki ślepe, zawierające wyłącznie wodę.
Po dodaniu roztworu reakcyjnego luminescencję mierzono za pomocą wielokanałowego czytnika mikropłytek SynergyTM 2 (BioTek) co 2 minuty przez 1 godzinę. Czytnik płytek wykonywał pomiary luminescencji co 2 minuty w ciągu tej godziny. Suma wszystkich 31 odczytów została obliczona w celu uzyskania wartości dla każdego dołka. Szacunkową wartość odpowiedzi MAMP dla każdego genotypu obliczono jako (średnia wartość luminescencji z trzech dołków eksperymentalnych – wartość z dołka próbnego) minus średnia wartość z dołka próby ślepej. Wartości z dołka próby ślepej były stale bliskie zeru.
Krążki liścioweNicotiana benthamianaW celu kontroli jakości w każdej płytce 96-dołkowej uwzględniono również jedną linię sorgo o wysokiej reakcji (SC0003) i jedną linię sorgo o niskiej reakcji (PI 6069) jako kontrole.
B. cookieiprzygotowanie szczepionki i szczepienie
B. cookieiInokulum przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem. W skrócie, ziarna sorgo moczono w wodzie przez trzy dni, płukano, umieszczano w kolbach stożkowych o pojemności 1 l i autoklawowano przez godzinę w ciśnieniu 15 psi i temperaturze 121°C. Następnie ziarna zaszczepiono około 5 ml zmacerowanej grzybni ze świeżej kulturyB. cookieiIzolaty LSLP18 pozostawiono na 2 tygodnie w temperaturze pokojowej, wstrząsając kolbami co 3 dni. Po 2 tygodniach zakażone grzybem ziarna sorgo wysuszono na powietrzu, a następnie przechowywano w temperaturze 4°C do momentu inokulacji polowej. To samo inokulum zastosowano w całym doświadczeniu i co roku przygotowywano na nowo. Do inokulacji wprowadzono 6–10 zakażonych ziaren do okółka 4–5-tygodniowych roślin sorgo. Zarodniki wytwarzane przez te grzyby zainicjowały infekcję młodych roślin sorgo w ciągu tygodnia.
Przygotowanie nasion
Przed sadzeniem na polu nasiona sorgo zaprawiano mieszanką fungicydu, insektycydu i środka zabezpieczającego, zawierającą ~1% fungicydu Spirato 480 FS, 4% fungicydu Sebring 480 FS i 3% środka zabezpieczającego nasiona Sorpro 940 ES. Następnie nasiona suszono na powietrzu przez 3 dni, co pozwoliło na pokrycie ich cienką warstwą mieszanki. Środek zabezpieczający pozwolił na zastosowanie herbicydu Dual Magnum jako środka przedwschodowego.
Ocena odporności na plamistość liści
SCP posadzono w Central Crops Research Station w Clayton, NC w dniach 14–15 czerwca 2017 r. i 20 czerwca 2018 r. w losowym układzie bloków kompletnych z dwoma powtórzeniami eksperymentu w każdym przypadku. Eksperymenty przeprowadzono w pojedynczych rzędach 1,8 m z szerokością rzędu 0,9 m, używając 10 nasion na poletko. Dwa rzędy graniczne posadzono wokół obwodu każdego eksperymentu, aby zapobiec efektom brzegowym. Eksperymenty zaszczepiono 20 lipca 2017 r. i 20 lipca 2018 r., w którym to momencie rośliny sorgo znajdowały się w 3. fazie wzrostu. Oceny dokonywano w skali od jednego do dziewięciu, gdzie rośliny nie wykazujące żadnych oznak choroby były oceniane jako dziewięć, a rośliny całkowicie martwe jako jeden. Dwie oceny wykonano w 2017 r., a cztery odczyty w 2018 r., zaczynając dwa tygodnie po zaszczepieniu każdego roku. sAUDPC (standaryzowane pole pod krzywą postępu choroby) obliczono w sposób opisany wcześniej.
Czas publikacji: 01-04-2021