Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić stałe wsparcie, wyświetlamy witrynę bez stylów ani JavaScript.
Fungicydy są często stosowane podczas kwitnienia owoców drzew i mogą zagrażać owadom zapylającym. Jednak niewiele wiadomo o tym, jak zapylacze niebędące pszczołami (np. pszczoły samotne, Osmia cornifrons) reagują na fungicydy kontaktowe i systemiczne powszechnie stosowane na jabłoniach podczas kwitnienia. Ta luka w wiedzy ogranicza decyzje regulacyjne określające bezpieczne stężenia i czas opryskiwania fungicydami. Oceniliśmy wpływ dwóch fungicydów kontaktowych (kaptanu i mankozebu) oraz czterech fungicydów międzywarstwowych/fitosystemowych (cyprocykliny, myklobutanilu, pirorobiny i trifloksystrobiny). Wpływ na przyrost masy larw, przeżywalność, stosunek płci i różnorodność bakterii. Ocenę przeprowadzono przy użyciu przewlekłego biotestu doustnego, w którym pyłek traktowano w trzech dawkach w oparciu o aktualnie zalecaną dawkę do stosowania w terenie (1X), połowę dawki (0,5X) i niską dawkę (0,1X). Wszystkie dawki mankozebu i pirytizoliny znacząco zmniejszyły masę ciała i przeżywalność larw. Następnie przeprowadziliśmy sekwencjonowanie genu 16S, aby scharakteryzować bakteriom larwalny mankozebu, fungicydu odpowiedzialnego za najwyższą śmiertelność. Odkryliśmy, że różnorodność i liczebność bakterii były znacząco zmniejszone u larw karmionych pyłkiem traktowanym mankozebem. Nasze wyniki laboratoryjne wskazują, że opryskiwanie niektórymi z tych fungicydów podczas kwitnienia jest szczególnie szkodliwe dla zdrowia O. cornifrons. Informacje te są istotne dla przyszłych decyzji zarządczych dotyczących zrównoważonego stosowania środków ochrony drzew owocowych i stanowią podstawę procesów regulacyjnych mających na celu ochronę zapylaczy.
Samotna murarka ogrodowa Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) została sprowadzona do Stanów Zjednoczonych z Japonii pod koniec lat 70. i na początku lat 80. XX wieku, a od tamtej pory gatunek ten odgrywa ważną rolę zapylania w zarządzanych ekosystemach. Naturalizowane populacje tej pszczoły są częścią około 50 gatunków dzikich pszczół, które uzupełniają pszczoły zapylające sady migdałowe i jabłoniowe w Stanach Zjednoczonych2,3. Pszczoły murarki ogrodowej stają w obliczu wielu wyzwań, w tym fragmentacji siedlisk, patogenów i pestycydów3,4. Spośród insektycydów, fungicydy zmniejszają zyski energetyczne, żerowanie5 i kondycję ciała6,7. Chociaż ostatnie badania sugerują, że zdrowie pszczół murarek ogrodowych jest bezpośrednio uzależnione od mikroorganizmów komensalnych i ektobakteryjnych8,9 ponieważ bakterie i grzyby mogą wpływać na odżywianie i reakcje immunologiczne, wpływ narażenia na fungicydy na różnorodność mikrobiologiczną pszczół murarek ogrodowych dopiero zaczyna być badany.
Fungicydy o różnym działaniu (kontaktowym i systemicznym) są rozpylane w sadach przed i w trakcie kwitnienia w celu zwalczania chorób takich jak parch jabłoni, gorzka zgnilizna, brunatna zgnilizna i mączniak prawdziwy10,11. Fungicydy są uważane za nieszkodliwe dla zapylaczy, dlatego zaleca się je ogrodnikom w okresie kwitnienia; Narażenie i spożycie tych fungicydów przez pszczoły jest stosunkowo dobrze znane, ponieważ jest częścią procesu rejestracji pestycydów przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska i wiele innych krajowych agencji regulacyjnych12,13,14. Jednak wpływ fungicydów na inne gatunki jest mniej znany, ponieważ nie są one wymagane na mocy umów o zezwolenie na dopuszczenie do obrotu w Stanach Zjednoczonych15. Ponadto na ogół nie ma znormalizowanych protokołów testowania pojedynczych pszczół16,17, a utrzymanie kolonii, które dostarczają pszczół do testów, jest trudne18. W Europie i USA coraz częściej przeprowadza się badania na różnych hodowanych pszczołach w celu zbadania wpływu pestycydów na dzikie pszczoły. Niedawno opracowano także ujednolicone protokoły dla O. cornifrons19.
Pszczoły rogate to monocyty i są komercyjnie wykorzystywane w uprawach karpi jako uzupełnienie lub zamiennik pszczół miodnych. Pszczoły te wyłaniają się między marcem a kwietniem, przy czym wczesne samce wyłaniają się trzy do czterech dni przed samicami. Po kopulacji samica aktywnie zbiera pyłek i nektar, aby zapewnić serię komórek lęgowych w rurkowatej jamie gniazda (naturalnej lub sztucznej)1,20. Jaja są składane na pyłku wewnątrz komórek; samica buduje następnie ścianę glinianą przed przygotowaniem kolejnej komórki. Larwy pierwszego stadium są zamknięte w kosmówce i żywią się płynami embrionalnymi. Od drugiego do piątego stadium (przedpoczwarki) larwy żywią się pyłkiem22. Po całkowitym wyczerpaniu zapasu pyłku larwy tworzą kokony, przepoczwarzają się i wyłaniają się jako osobniki dorosłe w tej samej komorze lęgowej, zwykle późnym latem20,23. Dorosłe osobniki wyłaniają się następnej wiosny. Przeżywalność osobników dorosłych jest związana z czystym zyskiem energii (przyrostem masy ciała) w oparciu o spożycie pokarmu. Zatem jakość odżywcza pyłku, a także inne czynniki, takie jak pogoda czy narażenie na pestycydy, są czynnikami determinującymi przeżywalność i zdrowie24.
Insektycydy i fungicydy stosowane przed kwitnieniem mogą przemieszczać się w obrębie naczyń krwionośnych rośliny w różnym stopniu, od translaminarnego (np. zdolnego do przemieszczania się z górnej powierzchni liści na dolną powierzchnię, jak niektóre fungicydy) 25 do prawdziwie systemicznych efektów. , które mogą przenikać przez koronę z korzeni, mogą dostać się do nektaru kwiatów jabłoni26, gdzie mogą zabijać dorosłe osobniki O. cornifrons27. Niektóre pestycydy przedostają się również do pyłku, wpływając na rozwój larw kukurydzy i powodując ich śmierć19. Inne badania wykazały, że niektóre fungicydy mogą znacząco zmienić zachowanie gniazdowania spokrewnionych gatunków O. lignaria28. Ponadto badania laboratoryjne i terenowe symulujące scenariusze narażenia na pestycydy (w tym fungicydy) wykazały, że pestycydy negatywnie wpływają na fizjologię22 morfologię29 i przeżywalność pszczół miodnych i niektórych pszczół samotnych. Różne opryski grzybobójcze stosowane bezpośrednio na otwarte kwiaty w okresie kwitnienia mogą zanieczyszczać pyłek zbierany przez osobniki dorosłe w celu rozwoju larw; skutki takiego działania wymagają jeszcze badań30.
Coraz częściej uznaje się, że rozwój larw jest pod wpływem pyłków i społeczności mikrobiologicznych układu pokarmowego. Mikrobiom pszczół miodnych wpływa na takie parametry, jak masa ciała31, zmiany metaboliczne22 i podatność na patogeny32. Poprzednie badania badały wpływ stadium rozwojowego, składników odżywczych i środowiska na mikrobiom pszczół samotnych. Badania te ujawniły podobieństwa w strukturze i liczebności mikrobiomów larw i pyłków33, a także najczęstszych rodzajów bakterii Pseudomonas i Delftia wśród gatunków pszczół samotnych. Jednak chociaż fungicydy były kojarzone ze strategiami ochrony zdrowia pszczół, wpływ fungicydów na mikrobiotę larw poprzez bezpośrednią ekspozycję doustną pozostaje niezbadany.
W tym badaniu przetestowano efekty rzeczywistych dawek sześciu powszechnie stosowanych fungicydów zarejestrowanych do stosowania na owocach drzew w Stanach Zjednoczonych, w tym fungicydów kontaktowych i systemicznych podawanych doustnie larwom ćmy kukurydzianej z zanieczyszczonej żywności. Stwierdziliśmy, że fungicydy kontaktowe i systemiczne zmniejszały przyrost masy ciała pszczół i zwiększały śmiertelność, przy czym najpoważniejsze skutki wiązały się z mankozebem i pirytiopidem. Następnie porównaliśmy różnorodność mikrobiologiczną larw karmionych dietą pyłkową traktowaną mankozebem z larw karmionych dietą kontrolną. Omawiamy potencjalne mechanizmy leżące u podstaw śmiertelności i implikacje dla programów zintegrowanego zarządzania szkodnikami i zapylaczami (IPPM)36.
Dorosłe osobniki O. cornifrons zimujące w kokonach uzyskano z Fruit Research Center w Biglerville w Pensylwanii i przechowywano w temperaturze od −3 do 2°C (±0,3°C). Przed eksperymentem (łącznie 600 kokonów). W maju 2022 r. 100 kokonów O. cornifrons przenoszono codziennie do plastikowych kubków (50 kokonów na kubek, DI 5 cm × 15 cm długości), a wewnątrz kubków umieszczano chusteczki, aby ułatwić otwieranie i zapewnić podłoże do żucia, zmniejszając stres u pszczół trzcinowych37. Umieść dwa plastikowe kubki zawierające kokony w klatce dla owadów (30 × 30 × 30 cm, BugDorm MegaView Science Co. Ltd., Tajwan) z 10 ml karmnikami zawierającymi 50% roztwór sacharozy i przechowuj przez cztery dni, aby zapewnić zamknięcie i kopulację. 23°C, wilgotność względna 60%, fotoperiod 10 l (niska intensywność): 14 dni. 100 zapłodnionych samic i samców wypuszczano każdego ranka przez sześć dni (100 dziennie) do dwóch sztucznych gniazd w okresie największego kwitnienia jabłoni (gniazdo pułapka: szerokość 33,66 × wysokość 30,48 × długość 46,99 cm; Rysunek uzupełniający 1). Umieszczony w Pennsylvania State Arboretum, w pobliżu wiśni (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), brzoskwini (Prunus persica 'Contender'), Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), gruszy (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), jabłoni wieńcowej (Malus coronaria) i licznych odmian jabłoni (Malus coronaria, Malus), jabłoni domowej 'Co-op 30′ Enterprise™, jabłoni Malus 'Co-Op 31′ Winecrisp™, begonii 'Freedom', begonii 'Golden Delicious', begonii 'Nova Spy'). Każda niebieska plastikowa budka dla ptaków mieści się na dwóch drewnianych skrzynkach. W każdej budce lęgowej znajdowało się 800 pustych tub z papieru pakowego (spiralnie otwartych, 0,8 cm średnicy wewnętrznej × 15 cm długości) (Jonesville Paper Tube Co., Michigan) umieszczonych w nieprzezroczystych tubach celofanowych (0,7 średnicy zewnętrznej, patrz). Zatyczki plastikowe (zatyczki T-1X) zapewniają miejsca do gniazdowania.
Obie skrzynki lęgowe były skierowane na wschód i przykryte zielonym plastikowym ogrodzeniem ogrodowym (model Everbilt nr 889250EB12, rozmiar otworu 5 × 5 cm, 0,95 m × 100 m), aby uniemożliwić dostęp gryzoniom i ptakom, i umieszczone na powierzchni gleby obok skrzynek lęgowych. Skrzynka lęgowa (Rysunek uzupełniający 1a). Jaja stonki kukurydzianej zbierano codziennie, pobierając 30 probówek z gniazd i transportując je do laboratorium. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie na końcu probówki, a następnie rozmontuj spiralną probówkę, aby odsłonić komórki lęgowe. Poszczególne jaja i ich pyłek usunięto za pomocą zakrzywionej szpatułki (zestaw narzędzi Microslide, BioQuip Products Inc., Kalifornia). Jaja inkubowano na wilgotnej bibule filtracyjnej i umieszczano w szalce Petriego na 2 godziny przed użyciem w naszych eksperymentach (Rysunek uzupełniający 1b-d).
W laboratorium oceniliśmy toksyczność doustną sześciu fungicydów stosowanych przed i w trakcie kwitnienia jabłoni w trzech stężeniach (0,1X, 0,5X i 1X, gdzie 1X to stężenie stosowane na 100 galonów wody/akr. Wysoka dawka polowa = stężenie w polu). , Tabela 1). Każde stężenie powtarzano 16 razy (n = 16). Dwa fungicydy kontaktowe (Tabela S1: mankozeb 2696,14 ppm i kaptan 2875,88 ppm) i cztery fungicydy systemiczne (Tabela S1: pirytiostrobina 250,14 ppm; trifloksystrobina 110,06 ppm; myklobutanil azol 75,12 ppm; cyprodynil 280,845 ppm) były toksyczne dla owoców, warzyw i roślin ozdobnych. Zhomogenizowaliśmy pyłek za pomocą młynka, przenieśliśmy 0,20 g do dołka (płytka Falcon 24-dołkowa) i dodaliśmy i wymieszaliśmy 1 μl roztworu fungicydu, aby utworzyć piramidalny pyłek z dołkami o głębokości 1 mm, w których umieszczono jaja. Umieść za pomocą mini szpatułki (Rysunek uzupełniający 1c,d). Płytki Falcon przechowywano w temperaturze pokojowej (25°C) i 70% wilgotności względnej. Porównaliśmy je z larwami kontrolnymi karmionymi jednorodną dietą pyłkową z dodatkiem czystej wody. Rejestrowaliśmy śmiertelność i mierzyliśmy masę larw co drugi dzień, aż larwy osiągnęły wiek przedpoczwarkowy, używając wagi analitycznej (Fisher Scientific, dokładność = 0,0001 g). Na koniec oceniono stosunek płci, otwierając kokon po 2,5 miesiącach.
DNA wyekstrahowano z całych larw O. cornifrons (n = 3 na warunki leczenia, pyłki traktowane i nietraktowane mankozebem) i przeprowadziliśmy analizy różnorodności mikrobiologicznej na tych próbkach, szczególnie dlatego, że w przypadku mankozebu najwyższą śmiertelność zaobserwowano u larw otrzymujących MnZn. DNA zostało wzmocnione, oczyszczone przy użyciu zestawu DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA (Zymo Research, Irvine, Kalifornia) i sekwencjonowane (600 cykli) na Illumina® MiSeq™ przy użyciu zestawu v3. Celowane sekwencjonowanie genów bakteryjnego 16S rybosomalnego RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu Quick-16S™ NGS Library Prep Kit (Zymo Research, Irvine, Kalifornia) przy użyciu starterów ukierunkowanych na region V3-V4 genu 16S rRNA. Dodatkowo wykonano sekwencjonowanie 18S z zastosowaniem 10% inkluzji PhiX, a amplifikację przeprowadzono przy użyciu pary starterów 18S001 i NS4.
Importuj i przetwarzaj sparowane odczyty39 przy użyciu potoku QIIME2 (v2022.11.1). Odczyty te zostały przycięte i połączone, a sekwencje chimeryczne zostały usunięte przy użyciu wtyczki DADA2 w QIIME2 (parowanie szumów qiime dada2)40. Przypisania klas 16S i 18S zostały wykonane przy użyciu wtyczki klasyfikatora obiektów Classify-sklearn i wstępnie wytrenowanego artefaktu silva-138-99-nb-classifier.
Wszystkie dane eksperymentalne zostały sprawdzone pod kątem normalności (Shapiro-Wilksa) i jednorodności wariancji (test Levene'a). Ponieważ zbiór danych nie spełniał założeń analizy parametrycznej, a transformacja nie ujednoliciła reszt, przeprowadziliśmy nieparametryczną dwukierunkową analizę wariancji (Kruskal-Wallis) z dwoma czynnikami [czas (trzy fazy 2, 5 i 8 dni) i fungicyd], aby ocenić wpływ leczenia na świeżą masę larw, a następnie przeprowadziliśmy post hoc nieparametryczne porównania parami przy użyciu testu Wilcoxona. Użyliśmy uogólnionego modelu liniowego (GLM) z rozkładem Poissona, aby porównać wpływ fungicydów na przeżywalność przy trzech stężeniach fungicydu41,42. W przypadku analizy różnicowej liczebności liczba wariantów sekwencji amplikonów (ASV) została zredukowana na poziomie rodzaju. Porównania różnicowej liczebności między grupami przy użyciu 16S (poziom rodzaju) i względnej liczebności 18S przeprowadzono przy użyciu uogólnionego modelu addytywnego dla położenia, skali i kształtu (GAMLSS) z rozkładami rodzinnymi rozszerzonymi o beta zero (BEZI), które zostały wymodelowane na makro. w Microbiome R43 (v1.1). 1). Usuń gatunki mitochondrialne i chloroplastowe przed analizą różnicową. Ze względu na różne poziomy taksonomiczne 18S, do analiz różnicowych użyto tylko najniższego poziomu każdego taksonu. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu R (v. 3.4.3., projekt CRAN) (zespół 2013).
Narażenie na mankozeb, pyritiostrobinę i trifloksystrobinę znacząco zmniejszyło przyrost masy ciała u O. cornifrons (ryc. 1). Efekty te były stale obserwowane dla wszystkich trzech ocenianych dawek (ryc. 1a–c). Cyklostrobina i myklobutanil nie zmniejszyły znacząco masy larw.
Średnia świeża masa larw chrząszcza mierzona w trzech punktach czasowych przy czterech rodzajach diety (jednorodny pokarm pyłkowy + fungicyd: kontrola, dawki 0,1X, 0,5X i 1X). (a) Niska dawka (0,1X): pierwszy punkt czasowy (dzień 1): χ2: 30,99, DF = 6; P < 0,0001, drugi punkt czasowy (dzień 5): 22,83, DF = 0,0009; trzeci punkt czasowy; punkt (dzień 8): χ2: 28,39, DF = 6; (b) połowa dawki (0,5X): pierwszy punkt czasowy (dzień 1): χ2: 35,67, DF = 6; P < 0,0001, drugi punkt czasowy (dzień pierwszy). ): χ2: 15,98, DF = 6; P = 0,0090; trzeci punkt czasowy (dzień 8) χ2: 16,47, DF = 6; (c) Miejsce lub pełna dawka (1X): pierwszy punkt czasowy (dzień 1) χ2: 20,64, P = 6; P = 0,0326, drugi punkt czasowy (dzień 5): χ2: 22,83, DF = 6; P = 0,0009; trzeci punkt czasowy (dzień 8): χ2: 28,39, DF = 6; nieparametryczna analiza wariancji. Słupki przedstawiają średnią ± błąd standardowy porównań parami (α = 0,05) (n = 16) *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001.
Przy najniższej dawce (0,1X) masa ciała larw została zmniejszona o 60% przy trifloksystrobinie, o 49% przy mankozebie, o 48% przy myklobutanilu i o 46% przy pyrytystrobinie (Rys. 1a). Po narażeniu na połowę dawki terenowej (0,5X) masa ciała larw mankozebu została zmniejszona o 86%, pirytiostrobiny o 52%, a trifloksystrobiny o 50% (Rys. 1b). Pełna dawka terenowa (1X) mankozebu zmniejszyła masę larw o 82%, pirytiostrobiny o 70%, a trifloksystrobiny, myklobutanilu i sangardu o około 30% (Rys. 1c).
Śmiertelność była najwyższa wśród larw karmionych pyłkiem traktowanym mankozebem, następnie pirytiostrobiną i trifloksystrobiną. Śmiertelność wzrastała wraz ze wzrostem dawek mankozebu i pirytizoliny (Ryc. 2; Tabela 2). Jednak śmiertelność stonki kukurydzianej wzrastała tylko nieznacznie wraz ze wzrostem stężenia trifloksystrobiny; cyprodinil i kaptan nie zwiększały znacząco śmiertelności w porównaniu z zabiegami kontrolnymi.
Porównano śmiertelność larw muchówek borer po spożyciu pyłku pojedynczo traktowanego sześcioma różnymi fungicydami. Mancozeb i pentopiramid były bardziej wrażliwe na doustne narażenie na larwy kukurydzy (GLM: χ = 29,45, DF = 20, P = 0,0059) (linia, nachylenie = 0,29, P < 0,001; nachylenie = 0,24, P < 0,00)).
Średnio we wszystkich rodzajach leczenia 39,05% pacjentów stanowiły kobiety, a 60,95% mężczyźni. Wśród grup kontrolnych odsetek kobiet wynosił 40% zarówno w badaniach z niską dawką (0,1X), jak i połową dawki (0,5X), a 30% w badaniach z dawką polową (1X). Przy dawce 0,1X wśród larw karmionych pyłkiem, leczonych mankozebem i myklobutanilem, 33,33% osobników dorosłych stanowiły samice, 22% osobników dorosłych stanowiły samice, 44% dorosłych larw stanowiły samice, 44% dorosłych larw stanowiły samice. samice, 41% dorosłych larw stanowiły samice, a w grupie kontrolnej odsetek ten wynosił 31% (ryc. 3a). Przy dawce 0,5-krotnej, 33% dorosłych robaków w grupie mankozebu i pyrytiostrobiny było samicami, 36% w grupie trifloksystrobiny, 41% w grupie myklobutanilu i 46% w grupie cyprostrobiny. Liczba ta wynosiła 53% w grupie kaptanu i 38% w grupie kontrolnej (ryc. 3b). Przy dawce 1X, 30% grupy mankozebu stanowiły kobiety, 36% grupy pyrytiostrobiny, 44% grupy trifloksystrobiny, 38% grupy myklobutanilu, 50% grupy kontrolnej stanowiły kobiety – 38,5% (ryc. 3c).
Procent samic i samców szkodników po narażeniu na działanie fungicydu w stadium larwalnym. (a) Niska dawka (0,1X). (b) Połowa dawki (0,5X). (c) Dawka polowa lub pełna dawka (1X).
Analiza sekwencji 16S wykazała, że grupa bakteryjna różniła się między larwami karmionymi pyłkiem traktowanym mankozebem a larwami karmionymi pyłkiem nietraktowanym (rys. 4a). Indeks mikrobiologiczny nietraktowanych larw karmionych pyłkiem był wyższy niż larw karmionych pyłkiem traktowanym mankozebem (rys. 4b). Chociaż zaobserwowana różnica w bogactwie między grupami nie była statystycznie istotna, była ona istotnie niższa od zaobserwowanej dla larw karmionych pyłkiem nietraktowanym (rys. 4c). Względna liczebność wykazała, że mikrobiota larw karmionych pyłkiem kontrolnym była bardziej zróżnicowana niż larw karmionych larwami traktowanymi mankozebem (rys. 5a). Analiza opisowa ujawniła obecność 28 rodzajów w próbkach kontrolnych i traktowanych mankozebem (rys. 5b). c Analiza z wykorzystaniem sekwencjonowania 18S nie wykazała istotnych różnic (Rysunek uzupełniający 2).
Profile SAV oparte na sekwencjach 16S porównano z bogactwem Shannona i obserwowanym bogactwem na poziomie typu. (a) Analiza głównych współrzędnych (PCoA) oparta na ogólnej strukturze społeczności mikrobiologicznej u nieleczonych larw karmionych pyłkiem lub kontrolnych (niebieskie) i karmionych mankozebem (pomarańczowe). Każdy punkt danych reprezentuje oddzielną próbkę. PCoA obliczono przy użyciu odległości Bray-Curtisa rozkładu t wielowymiarowego. Owale reprezentują 80% poziom ufności. (b) Wykres pudełkowy, surowe dane o bogactwie Shannona (punkty) i c. Obserwowalne bogactwo. Wykresy pudełkowe pokazują pola dla linii mediany, zakresu interkwartylowego (IQR) i 1,5 × IQR (n = 3).
Skład społeczności mikrobiologicznych larw karmionych pyłkiem traktowanym mankozebem i nietraktowanym. (a) Względna liczebność rodzajów mikroorganizmów u larw. (b) Mapa cieplna zidentyfikowanych społeczności mikrobiologicznych. Delftia (współczynnik szans (OR) = 0,67, P = 0,0030) i Pseudomonas (OR = 0,3, P = 0,0074), Microbacterium (OR = 0,75, P = 0,0617) (OR = 1,5, P = 0,0060); Wiersze mapy cieplnej są grupowane przy użyciu odległości korelacyjnej i średniej łączności.
Nasze wyniki pokazują, że doustna ekspozycja na fungicydy kontaktowe (mancozeb) i systemiczne (pyrostrobin i trifloksystrobina), szeroko stosowane podczas kwitnienia, znacząco zmniejszyła przyrost masy ciała i zwiększyła śmiertelność larw kukurydzy. Ponadto mancozeb znacząco zmniejszył różnorodność i bogactwo mikrobiomu w fazie przedpoczwarkowej. Myklobutanil, inny systemiczny fungicyd, znacząco zmniejszył przyrost masy ciała larw przy wszystkich trzech dawkach. Efekt ten był widoczny w drugim (dzień 5) i trzecim (dzień 8) punkcie czasowym. Natomiast cyprodinil i kaptan nie zmniejszyły znacząco przyrostu masy ciała ani przeżywalności w porównaniu z grupą kontrolną. Według naszej wiedzy, ta praca jest pierwszą, która określa wpływ dawek polowych różnych fungicydów stosowanych w celu ochrony upraw kukurydzy poprzez bezpośrednią ekspozycję na pyłek.
Wszystkie zabiegi fungicydowe znacząco zmniejszyły przyrost masy ciała w porównaniu z zabiegami kontrolnymi. Mancozeb miał największy wpływ na przyrost masy ciała larw, ze średnią redukcją o 51%, a następnie pirytiostrobina. Jednak inne badania nie wykazały niekorzystnych skutków dawek polowych fungicydów na stadia larwalne44. Chociaż wykazano, że biocydy ditiokarbaminianowe mają niską toksyczność ostrą45, bisditiokarbaminiany etylenu (EBDCS), takie jak mancozeb, mogą ulegać degradacji do siarczku etylenu mocznika. Biorąc pod uwagę jego działanie mutagenne u innych zwierząt, ten produkt degradacji może być odpowiedzialny za obserwowane efekty46,47. Poprzednie badania wykazały, że na powstawanie tiomocznika etylenowego wpływają takie czynniki, jak podwyższona temperatura48, poziom wilgotności49 i długość przechowywania produktu50. Właściwe warunki przechowywania biocydów mogą łagodzić te skutki uboczne. Ponadto Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności wyraził obawy dotyczące toksyczności pirytiopidu, który okazał się rakotwórczy dla układu pokarmowego innych zwierząt51.
Doustne podawanie mankozebu, pirytiostrobiny i trifloksystrobiny zwiększa śmiertelność larw stonki kukurydzianej. Natomiast myklobutanil, cyprocyklina i kaptan nie miały wpływu na śmiertelność. Wyniki te różnią się od wyników Ladurnera i in.52, którzy wykazali, że kaptan znacząco zmniejszył przeżywalność dorosłych osobników O. lignaria i Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apisidae). Ponadto stwierdzono, że fungicydy, takie jak kaptan i boskalid, powodują śmiertelność larw52,53,54 lub zmieniają zachowania żywieniowe55. Zmiany te z kolei mogą wpływać na jakość odżywczą pyłku i ostatecznie na zysk energetyczny stadium larwalnego. Śmiertelność zaobserwowana w grupie kontrolnej była zgodna z wynikami innych badań56,57.
Obserwowany w naszej pracy korzystny dla samców stosunek płci można wyjaśnić czynnikami takimi jak niewystarczające krycie i złe warunki pogodowe podczas kwitnienia, jak wcześniej sugerowali Vicens i Bosch w przypadku O. cornuta. Chociaż samice i samce w naszym badaniu miały cztery dni na krycie (okres ogólnie uważany za wystarczający do udanego krycia), celowo zmniejszyliśmy intensywność światła, aby zminimalizować stres. Jednak ta modyfikacja może nieumyślnie zakłócić proces krycia61. Ponadto pszczoły doświadczają kilku dni niekorzystnych warunków pogodowych, w tym deszczu i niskich temperatur (<5°C), co również może negatywnie wpłynąć na powodzenie krycia4,23.
Chociaż nasze badanie koncentrowało się na całym mikrobiomie larw, nasze wyniki dostarczają wglądu w potencjalne relacje między społecznościami bakteryjnymi, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla odżywiania pszczół i narażenia na fungicydy. Na przykład larwy karmione pyłkiem traktowanym mankozebem miały znacznie zmniejszoną strukturę i liczebność społeczności mikrobiologicznej w porównaniu z larwami karmionymi pyłkiem nietraktowanym. U larw spożywających pyłek nietraktowany grupy bakteryjne Proteobacteria i Actinobacteria dominowały i były przeważnie tlenowe lub fakultatywnie tlenowe. Bakterie z Delft, zwykle związane z gatunkami pszczół samotnych, są znane z aktywności antybiotycznej, co wskazuje na potencjalną rolę ochronną przed patogenami. Inny gatunek bakterii, Pseudomonas, był liczny w larwach karmionych pyłkiem nietraktowanym, ale był znacznie zmniejszony w larwach traktowanych mankozebem. Nasze wyniki potwierdzają wcześniejsze badania identyfikujące Pseudomonas jako jeden z najliczniejszych rodzajów u O. bicornis35 i innych os samotnych34. Chociaż nie zbadano dowodów eksperymentalnych na rolę Pseudomonas w zdrowiu O. cornifrons, wykazano, że bakteria ta promuje syntezę toksyn ochronnych u chrząszcza Paederus fuscipes i promuje metabolizm argininy in vitro 35, 65. Obserwacje te sugerują potencjalną rolę w obronie wirusowej i bakteryjnej w czasie rozwoju larw O. cornifrons. Microbacterium to kolejny rodzaj zidentyfikowany w naszym badaniu, o którym doniesiono, że występuje w dużej liczbie u larw muchy Black Soldier w warunkach głodu66. U larw O. cornifrons mikrobakterie mogą przyczyniać się do równowagi i odporności mikrobiomu jelitowego w warunkach stresowych. Ponadto Rhodococcus występuje u larw O. cornifrons i jest znany ze swoich zdolności detoksykacyjnych67. Ten rodzaj występuje również w jelitach A. florea, ale w bardzo małej liczebności68. Nasze wyniki wskazują na obecność wielu wariantów genetycznych w licznych taksonach mikrobiologicznych, które mogą zmieniać procesy metaboliczne u larw. Jednak konieczne jest lepsze zrozumienie różnorodności funkcjonalnej O. cornifrons.
Podsumowując, wyniki wskazują, że mankozeb, pirytiostrobina i trifloksystrobina zmniejszyły przyrost masy ciała i zwiększyły śmiertelność larw stonki kukurydzianej. Chociaż rosną obawy dotyczące wpływu fungicydów na zapylacze, istnieje potrzeba lepszego zrozumienia wpływu metabolitów resztkowych tych związków. Wyniki te można włączyć do zaleceń dotyczących zintegrowanych programów zarządzania zapylaczami, które pomogą rolnikom unikać stosowania niektórych fungicydów przed i w trakcie kwitnienia drzew owocowych poprzez dobór fungicydów i zmianę czasu ich stosowania lub poprzez zachęcanie do stosowania mniej szkodliwych alternatyw36. Informacje te są ważne dla opracowywania zaleceń dotyczących stosowania pestycydów, takich jak dostosowywanie istniejących programów oprysków i zmiana czasu oprysków przy wyborze fungicydów lub promowanie stosowania mniej niebezpiecznych alternatyw. Konieczne są dalsze badania nad niekorzystnym wpływem fungicydów na proporcje płci, zachowania żywieniowe, mikrobiom jelitowy i mechanizmy molekularne leżące u podstaw utraty masy ciała i śmiertelności stonki kukurydzianej.
Dane źródłowe 1, 2 i 3 na rysunkach 1 i 2 zostały złożone w repozytorium danych figshare DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 i https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. Sekwencje analizowane w bieżącym badaniu (rys. 4, 5) są dostępne w repozytorium NCBI SRA pod numerem akcesyjnym PRJNA1023565.
Bosch, J. i Kemp, WP Rozwój i ugruntowanie gatunków pszczół miodnych jako zapylaczy upraw rolnych: przykład rodzaju Osmia. (Hymenoptera: Megachilidae) i drzew owocowych. bull. Ntomore. resource. 92, 3–16 (2002).
Parker, MG i in. Praktyki zapylania i postrzeganie alternatywnych zapylaczy wśród plantatorów jabłek w Nowym Jorku i Pensylwanii. aktualizacja. Rolnictwo. systemy żywnościowe. 35, 1–14 (2020).
Koch I., Lonsdorf EW, Artz DR, Pitts-Singer TL i Ricketts TH Ekologia i ekonomika zapylania migdałów przy użyciu rodzimych pszczół. J. Economics. Ntomore. 111, 16–25 (2018).
Lee, E., He, Y. i Park, Y.-L. Wpływ zmian klimatycznych na fenologię tragopanów: implikacje dla zarządzania populacją. Climb. Change 150, 305–317 (2018).
Artz, DR i Pitts-Singer, TL Wpływ oprysków fungicydami i adiuwantami na zachowanie gniazdowania dwóch hodowanych pszczół samotnic (Osmia lignaria i Megachile rotundata). PloS One 10, e0135688 (2015).
Beauvais, S. i in. Niskotoksyczny fungicyd uprawowy (fenbukonazol) zakłóca sygnały jakości reprodukcyjnej samców, co skutkuje zmniejszonym powodzeniem godowym u dzikich pszczół samotnych. J. Apps. ecology. 59, 1596–1607 (2022).
Sgolastra F. i in. Neonikotynoidowe insektycydy i biosynteza ergosterolu hamują synergistyczną śmiertelność fungicydów u trzech gatunków pszczół. Zwalczanie szkodników. nauka. 73, 1236–1243 (2017).
Kuhneman JG, Gillung J, Van Dyck MT, Fordyce RF. i Danforth BN Larwy os samotnych zmieniają różnorodność bakterii dostarczanych przez pyłek pszczołom Osmia cornifrons (Megachilidae) gniazdującym na łodydze. front. mikroorganizm. 13, 1057626 (2023).
Dharampal PS, Danforth BN i Steffan SA Ektosymbiotyczne mikroorganizmy w sfermentowanym pyłku są tak samo ważne dla rozwoju pszczół samotniczych jak sam pyłek. ekologia. ewolucja. 12. e8788 (2022).
Kelderer M, Manici LM, Caputo F i Thalheimer M. Sadzenie międzyrzędowe w sadach jabłoniowych w celu zwalczania chorób ponownego wysiewu: praktyczne badanie skuteczności oparte na wskaźnikach mikrobiologicznych. Plant Soil 357, 381–393 (2012).
Martin PL, Kravchik T., Khodadadi F., Achimovich SG i Peter KA Gorzka zgnilizna jabłek w środkowoatlantyckich Stanach Zjednoczonych: ocena gatunków sprawczych i wpływu regionalnych warunków pogodowych oraz podatności odmian. Fitopatologia 111, 966–981 (2021).
Cullen MG, Thompson LJ, Carolan JK, Stout JK. i Stanley DA Fungicydy, herbicydy i pszczoły: systematyczny przegląd istniejących badań i metod. PLoS One 14, e0225743 (2019).
Pilling, ED i Jepson, PC Synergistyczne działanie fungicydów EBI i insektycydów pyretroidowych na pszczoły miodne (Apis mellifera). szkodniki nauka. 39, 293–297 (1993).
Mussen, EC, Lopez, JE i Peng, CY Wpływ wybranych fungicydów na wzrost i rozwój larw pszczoły miodnej Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae). Środa. Ntomore. 33, 1151-1154 (2004).
Van Dyke, M., Mullen, E., Wickstead, D. i McArt, S. Przewodnik decyzyjny dotyczący stosowania pestycydów w celu ochrony zapylaczy w sadach drzewiastych (Cornell University, 2018).
Iwasaki, JM i Hogendoorn, K. Narażenie pszczół na środki inne niż pestycydy: przegląd metod i zgłoszonych wyników. Rolnictwo. ekosystem. Środa. 314, 107423 (2021).
Kopit AM, Klinger E, Cox-Foster DL, Ramirez RA. i Pitts-Singer TL Wpływ rodzaju dostawy i narażenia na pestycydy na rozwój larw Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Środa. Ntomore. 51, 240–251 (2022).
Kopit AM i Pitts-Singer TL Drogi narażenia na pestycydy samotnych pszczół z pustymi gniazdami. Środa. Ntomore. 47, 499–510 (2018).
Pan, NT i in. Nowy protokół biotestu połknięcia w celu oceny toksyczności pestycydów u dorosłych pszczół japońskich (Osmia cornifrons). the science. Reports 10, 9517 (2020).
Czas publikacji: 14-05-2024