Dziękujemy za odwiedzenie strony Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Fungicydy są często stosowane podczas kwitnienia drzew owocowych i mogą zagrażać owadom zapylającym. Jednak niewiele wiadomo na temat reakcji zapylaczy innych niż pszczoły (np. pszczoły samotnice, Osmia cornifrons) na fungicydy kontaktowe i systemiczne powszechnie stosowane na jabłoniach podczas kwitnienia. Ta luka w wiedzy ogranicza decyzje regulacyjne dotyczące określania bezpiecznych stężeń i terminów oprysków fungicydami. Oceniliśmy wpływ dwóch fungicydów kontaktowych (kaptan i mankozeb) oraz czterech fungicydów międzywarstwowych/fitosystemowych (cyprocyklina, myklobutanil, pyrostrobin i trifloksystrobina). Wpływ na przyrost masy ciała larw, przeżywalność, stosunek płci i różnorodność bakterii. Ocenę przeprowadzono z wykorzystaniem przewlekłego biotestu doustnego, w którym pyłek traktowano w trzech dawkach, w oparciu o aktualnie zalecaną dawkę do stosowania w polu (1X), połowę dawki (0,5X) i niską dawkę (0,1X). Wszystkie dawki mankozebu i pyritisoliny istotnie zmniejszyły masę ciała i przeżywalność larw. Następnie przeprowadziliśmy sekwencjonowanie genu 16S, aby scharakteryzować bakteriom larw mankozebu, fungicydu odpowiedzialnego za najwyższą śmiertelność. Stwierdziliśmy, że różnorodność i liczebność bakterii były znacząco zmniejszone u larw karmionych pyłkiem kwiatowym traktowanym mankozebem. Wyniki naszych badań laboratoryjnych wskazują, że opryskiwanie niektórymi z tych fungicydów w okresie kwitnienia jest szczególnie szkodliwe dla zdrowia O. cornifrons. Informacje te są istotne dla przyszłych decyzji dotyczących zrównoważonego stosowania środków ochrony drzew owocowych i stanowią podstawę procesów regulacyjnych mających na celu ochronę zapylaczy.
Samotna murarka ogrodowa Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) została sprowadzona do Stanów Zjednoczonych z Japonii pod koniec lat 70. i na początku lat 80. XX wieku, a od tamtej pory gatunek ten odgrywa ważną rolę zapylania w zarządzanych ekosystemach. Naturalizowane populacje tej pszczoły stanowią część około 50 gatunków dzikich pszczół, które uzupełniają pszczoły zapylające sady migdałowe i jabłoniowe w Stanach Zjednoczonych2,3. Pszczoły murarki ogrodowej borykają się z wieloma wyzwaniami, w tym fragmentacją siedlisk, patogenami i pestycydami3,4. Spośród insektycydów, fungicydy zmniejszają przyrost energii, żerowanie5 i kondycję organizmu6,7. Chociaż najnowsze badania sugerują, że zdrowie pszczół murarek ogrodowych jest bezpośrednio uzależnione od mikroorganizmów komensalnych i ektobakteryjnych8,9, ponieważ bakterie i grzyby mogą wpływać na odżywianie i reakcje immunologiczne, wpływ ekspozycji na fungicydy na różnorodność mikrobiologiczną pszczół murarek ogrodowych dopiero zaczyna być badany.
Fungicydy o różnym działaniu (kontaktowym i systemicznym) są opryskiwane w sadach przed i w trakcie kwitnienia w celu zwalczania chorób takich jak parch jabłoni, gorzka zgnilizna, brunatna zgnilizna i mączniak prawdziwy10,11. Fungicydy są uważane za nieszkodliwe dla zapylaczy, dlatego zaleca się je ogrodnikom w okresie kwitnienia; Narażenie i spożycie tych fungicydów przez pszczoły jest stosunkowo dobrze znane, ponieważ jest częścią procesu rejestracji pestycydów przez Amerykańską Agencję Ochrony Środowiska i wiele innych krajowych agencji regulacyjnych12,13,14. Jednak wpływ fungicydów na inne gatunki jest mniej znany, ponieważ nie są one wymagane w ramach umów o dopuszczeniu do obrotu w Stanach Zjednoczonych15. Ponadto na ogół nie ma znormalizowanych protokołów testowania pojedynczych pszczół16,17, a utrzymanie kolonii dostarczających pszczoły do testów jest trudne18. W Europie i USA coraz częściej przeprowadza się badania na różnych hodowanych pszczołach, aby zbadać wpływ pestycydów na dzikie pszczoły. Niedawno opracowano także ujednolicone protokoły dla O. cornifrons19.
Pszczoły rogate to monocyty i są komercyjnie wykorzystywane w uprawach karpi jako uzupełnienie lub zamiennik pszczół miodnych. Pszczoły te wylęgają się między marcem a kwietniem, przy czym przedwcześnie dojrzałe samce wylęgają się trzy do czterech dni przed samicami. Po kopulacji samica aktywnie zbiera pyłek i nektar, aby zapewnić serię komórek lęgowych w rurkowatej jamie gniazda (naturalnej lub sztucznej)1,20. Jaja składane są na pyłku wewnątrz komórek; samica następnie buduje glinianą ścianę przed przygotowaniem kolejnej komórki. Larwy pierwszego stadium larwalnego są zamknięte w kosmówce i żywią się płynami embrionalnymi. Od drugiego do piątego stadium larwalnego (przedpoczwarki) larwy żywią się pyłkiem22. Po całkowitym wyczerpaniu zapasów pyłku larwy tworzą kokony, przepoczwarzają się i wylęgają jako osobniki dorosłe w tej samej komorze lęgowej, zwykle późnym latem20,23. Dorosłe osobniki wylęgają się następnej wiosny. Przeżywalność osobników dorosłych jest związana z przyrostem energii netto (przyrostem masy ciała) w oparciu o spożycie pokarmu. Zatem jakość odżywcza pyłku, a także inne czynniki, takie jak pogoda czy narażenie na pestycydy, są czynnikami determinującymi przeżywalność i zdrowie24.
Insektycydy i fungicydy stosowane przed kwitnieniem mogą przemieszczać się w obrębie naczyń krwionośnych rośliny w różnym stopniu, od translaminarnego (np. zdolnego do przemieszczania się z górnej powierzchni liści na dolną powierzchnię, jak niektóre fungicydy) 25 do prawdziwie systemicznych efektów. , które mogą przenikać przez koronę z korzeni, mogą dostać się do nektaru kwiatów jabłoni26, gdzie mogą zabić dorosłe osobniki O. cornifrons27. Niektóre pestycydy przedostają się również do pyłku, wpływając na rozwój larw kukurydzy i powodując ich śmierć19. Inne badania wykazały, że niektóre fungicydy mogą znacząco zmienić zachowanie gniazdowania spokrewnionych gatunków O. lignaria28. Ponadto badania laboratoryjne i terenowe symulujące scenariusze narażenia na pestycydy (w tym fungicydy) wykazały, że pestycydy negatywnie wpływają na fizjologię22 morfologię29 i przeżywalność pszczół miodnych i niektórych pszczół samotnic. Różne środki grzybobójcze stosowane bezpośrednio na otwarte kwiaty w okresie kwitnienia mogą zanieczyszczać pyłek zbierany przez osobniki dorosłe w celu rozwoju larw; skutki takiego działania wymagają jeszcze badań30.
Coraz częściej uznaje się, że na rozwój larw wpływają pyłki i mikroorganizmy układu pokarmowego. Mikrobiom pszczół miodnych wpływa na takie parametry, jak masa ciała31, zmiany metaboliczne22 i podatność na patogeny32. Wcześniejsze badania dotyczyły wpływu stadium rozwoju, składników odżywczych i środowiska na mikrobiom pszczół samotnic. Badania te ujawniły podobieństwa w strukturze i liczebności mikrobiomów larw i pyłku33, a także najpowszechniejszych rodzajów bakterii Pseudomonas i Delftia, wśród gatunków pszczół samotnic. Jednakże, chociaż fungicydy są powiązane ze strategiami ochrony zdrowia pszczół, ich wpływ na mikrobiom larw poprzez bezpośrednią ekspozycję doustną pozostaje niezbadany.
W niniejszym badaniu przetestowano wpływ dawek sześciu powszechnie stosowanych fungicydów zarejestrowanych do stosowania na owocach drzew owocowych w Stanach Zjednoczonych, w tym fungicydów kontaktowych i systemicznych podawanych doustnie larwom stonki kukurydzianej z zanieczyszczonej żywności. Stwierdziliśmy, że fungicydy kontaktowe i systemiczne zmniejszały przyrost masy ciała pszczół i zwiększały ich śmiertelność, przy czym najpoważniejsze skutki obserwowano w przypadku mankozebu i pirytiopidu. Następnie porównaliśmy różnorodność mikrobiologiczną larw karmionych dietą pyłkową z dodatkiem mankozebu z larwami karmionymi dietą kontrolną. Omawiamy potencjalne mechanizmy leżące u podstaw śmiertelności oraz implikacje dla programów zintegrowanego zarządzania szkodnikami i zapylaczami (IPPM)36.
Dorosłe osobniki O. cornifrons zimujące w kokonach uzyskano z Fruit Research Center w Biglerville w Pensylwanii i przechowywano w temperaturze od −3 do 2°C (±0,3°C). Przed eksperymentem (łącznie 600 kokonów) w maju 2022 r. codziennie przenoszono 100 kokonów O. cornifrons do plastikowych kubków (50 kokonów na kubek, DI 5 cm × 15 cm długości), a wewnątrz kubków umieszczano chusteczki, aby ułatwić otwieranie i zapewnić żuwalne podłoże, zmniejszając stres u pszczół trzcinowych37. Umieść dwa plastikowe kubki zawierające kokony w klatce dla owadów (30 × 30 × 30 cm, BugDorm MegaView Science Co. Ltd., Tajwan) z 10 ml karmnikami zawierającymi 50% roztwór sacharozy i przechowuj przez cztery dni, aby zapewnić zamknięcie i kopulację. 23°C, wilgotność względna 60%, fotoperiod 10 l (niska intensywność): 14 dni. 100 zapłodnionych samic i samców wypuszczano każdego ranka przez sześć dni (100 dziennie) do dwóch sztucznych gniazd w okresie największego kwitnienia jabłoni (gniazdo-pułapka: szerokość 33,66 × wysokość 30,48 × długość 46,99 cm; Rysunek uzupełniający 1). Umieszczono w Pennsylvania State Arboretum, w pobliżu wiśni (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), brzoskwini (Prunus persica 'Contender'), Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), gruszy (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), jabłoni wieńcowej (Malus coronaria) oraz licznych odmian jabłoni (Malus coronaria, Malus), jabłoni domowej 'Co-op 30′ Enterprise™, jabłoni Malus 'Co-Op 31′ Winecrisp™, begonii 'Freedom', begonii 'Golden Delicious', begonii 'Nova Spy'). Każda niebieska plastikowa budka dla ptaków mieści się na dwóch drewnianych skrzynkach. W każdej budce lęgowej znajdowało się 800 pustych rurek z papieru pakowego (spiralne otwarcie, średnica wewnętrzna 0,8 cm × długość 15 cm) (Jonesville Paper Tube Co., Michigan) umieszczonych w nieprzezroczystych rurkach celofanowych (średnica zewnętrzna 0,7 cm, patrz). Zatyczki plastikowe (zatyczki T-1X) zapewniają miejsca do gniazdowania.
Obie budki lęgowe zwrócone były na wschód i przykryte zielonym plastikowym ogrodzeniem ogrodowym (model Everbilt nr 889250EB12, rozmiar otworu 5 × 5 cm, 0,95 m × 100 m), aby uniemożliwić dostęp gryzoniom i ptakom, a następnie umieszczone na powierzchni gleby obok budek lęgowych. Budka lęgowa (Rysunek uzupełniający 1a). Jaja stonki kukurydzianej zbierano codziennie, pobierając 30 probówek z gniazd i przenosząc je do laboratorium. Za pomocą nożyczek nacięto koniec probówki, a następnie rozmontowano ją, aby odsłonić komórki lęgowe. Poszczególne jaja wraz z pyłkiem usuwano zakrzywioną szpatułką (zestaw narzędzi Microslide, BioQuip Products Inc., Kalifornia). Jaja inkubowano na wilgotnej bibule filtracyjnej i umieszczano w szalce Petriego na 2 godziny przed użyciem w naszych eksperymentach (Rysunek uzupełniający 1b-d).
W laboratorium oceniliśmy toksyczność doustną sześciu fungicydów zastosowanych przed i w trakcie kwitnienia jabłoni w trzech stężeniach (0,1X, 0,5X i 1X, gdzie 1X to wartość stosowana na 100 galonów wody/akr. Najwyższa dawka polowa = stężenie w polu). , Tabela 1). Każde stężenie powtórzono 16 razy (n = 16). Dwa fungicydy kontaktowe (Tabela S1: mankozeb 2696,14 ppm i kaptan 2875,88 ppm) i cztery fungicydy systemiczne (Tabela S1: pirytiostrobina 250,14 ppm; trifloksystrobina 110,06 ppm; myklobutanilazol 75,12 ppm; cyprodynil 280,845 ppm) były toksyczne dla owoców, warzyw i roślin ozdobnych. Zhomogenizowaliśmy pyłek za pomocą młynka, przenieśliśmy 0,20 g do dołka (płytka Falcon z 24 dołkami) i dodaliśmy 1 μl roztworu fungicydu, mieszając, aby utworzyć piramidalny pyłek z dołkami o głębokości 1 mm, w których umieszczono jaja. Umieściliśmy je za pomocą mini szpatułki (Rysunek uzupełniający 1c, d). Płytki Falcon przechowywano w temperaturze pokojowej (25°C) i przy wilgotności względnej 70%. Porównaliśmy je z larwami kontrolnymi karmionymi jednorodną dietą pyłkową z dodatkiem czystej wody. Rejestrowaliśmy śmiertelność i mierzyliśmy masę larw co drugi dzień, aż do osiągnięcia wieku przedpoczwarkowego, za pomocą wagi analitycznej (Fisher Scientific, dokładność = 0,0001 g). Na koniec, po 2,5 miesiącu, oceniono stosunek płci poprzez otwarcie kokonu.
DNA wyekstrahowano z całych larw O. cornifrons (n = 3 na każdy rodzaj leczenia, pyłek traktowany i nietraktowany mankozebem) i przeprowadzono analizę różnorodności mikrobiologicznej tych próbek, szczególnie dlatego, że w przypadku mankozebu zaobserwowano najwyższą śmiertelność larw otrzymujących MnZn. DNA amplifikowano, oczyszczono za pomocą zestawu DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA (Zymo Research, Irvine, Kalifornia) i sekwencjonowano (600 cykli) na Illumina® MiSeq™ przy użyciu zestawu v3. Celowane sekwencjonowanie genów bakteryjnego rybosomalnego RNA 16S przeprowadzono za pomocą zestawu Quick-16S™ NGS Library Prep Kit (Zymo Research, Irvine, Kalifornia) z użyciem starterów ukierunkowanych na region V3-V4 genu 16S rRNA. Dodatkowo wykonano sekwencjonowanie 18S z użyciem 10% inkluzji PhiX, a amplifikację przeprowadzono przy użyciu pary starterów 18S001 i NS4.
Import i przetwarzanie sparowanych odczytów39 za pomocą potoku QIIME2 (wersja 2022.11.1). Odczyty te zostały przycięte i scalone, a sekwencje chimeryczne usunięto za pomocą wtyczki DADA2 w QIIME2 (parowanie szumów QIIME Dada2)40. Przypisanie klas 16S i 18S przeprowadzono za pomocą wtyczki klasyfikatora obiektów Classify-sklearn oraz wstępnie wytrenowanego artefaktu silva-138-99-nb-classifier.
Wszystkie dane eksperymentalne sprawdzono pod kątem normalności rozkładu (Shapiro-Wilksa) i jednorodności wariancji (test Levene'a). Ponieważ zbiór danych nie spełniał założeń analizy parametrycznej, a transformacja nie standaryzowała reszt, przeprowadziliśmy nieparametryczną dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) (Kruskala-Wallisa) z dwoma czynnikami [czas (trzy fazy: 2, 5 i 8 dni) oraz fungicyd] w celu oceny wpływu zabiegu na świeżą masę larw, a następnie przeprowadzono post hoc nieparametryczne porównania parami za pomocą testu Wilcoxona. Zastosowaliśmy uogólniony model liniowy (GLM) z rozkładem Poissona do porównania wpływu fungicydów na przeżywalność dla trzech stężeń fungicydu41,42. W analizie różnicowej liczebności, liczba wariantów sekwencji amplikonów (ASV) została zredukowana na poziomie rodzaju. Porównania różnic w liczebności między grupami z wykorzystaniem 16S (na poziomie rodzaju) i względnej liczebności 18S przeprowadzono za pomocą uogólnionego addytywnego modelu położenia, skali i kształtu (GAMLSS) z rozkładami rodzinnymi BEZI (wyolbrzymionymi przez beta-zero), które zmodelowano na podstawie makroskopowej analizy w Microbiome R43 (wersja 1.1). 1). Przed analizą różnicową należy usunąć gatunki mitochondrialne i chloroplastowe. Ze względu na różne poziomy taksonomiczne 18S, do analiz różnicowych wykorzystano tylko najniższy poziom każdego taksonu. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania R (wersja 3.4.3., projekt CRAN) (zespół 2013).
Narażenie na mankozeb, pirytiostrobinę i trifloksystrobinę znacząco zmniejszyło przyrost masy ciała u O. cornifrons (ryc. 1). Efekty te obserwowano konsekwentnie dla wszystkich trzech ocenianych dawek (ryc. 1a–c). Cyklostrobina i myklobutanil nie spowodowały istotnego zmniejszenia masy larw.
Średnia świeża masa larw stonki mierzona w trzech punktach czasowych przy czterech rodzajach diety (jednorodny pokarm pyłkowy + fungicyd: kontrola, dawki 0,1X, 0,5X i 1X). (a) Niska dawka (0,1X): pierwszy punkt czasowy (dzień 1): χ2: 30,99, DF = 6; P < 0,0001, drugi punkt czasowy (dzień 5): 22,83, DF = 0,0009; trzeci punkt czasowy (dzień 8): χ2: 28,39, DF = 6; (b) połowa dawki (0,5X): pierwszy punkt czasowy (dzień 1): χ2: 35,67, DF = 6; P < 0,0001, drugi punkt czasowy (dzień pierwszy). ): χ2: 15,98, DF = 6; P = 0,0090; trzeci punkt czasowy (dzień 8) χ2: 16,47, DF = 6; (c) Miejsce lub pełna dawka (1X): pierwszy punkt czasowy (dzień 1) χ2: 20,64, P = 6; P = 0,0326, drugi punkt czasowy (dzień 5): χ2: 22,83, DF = 6; P = 0,0009; trzeci punkt czasowy (dzień 8): χ2: 28,39, DF = 6; nieparametryczna analiza wariancji. Słupki przedstawiają średnią ± błąd standardowy porównań parami (α = 0,05) (n = 16) *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001.
Przy najniższej dawce (0,1X) masa ciała larw zmniejszyła się o 60% w przypadku trifloksystrobiny, o 49% w przypadku mankozebu, o 48% w przypadku myklobutanilu i o 46% w przypadku pyrytystrobiny (ryc. 1a). Po narażeniu na połowę dawki polowej (0,5X) masa ciała larw mankozebu zmniejszyła się o 86%, pirytiostrobiny o 52%, a trifloksystrobiny o 50% (ryc. 1b). Pełna dawka polowa (1X) mankozebu zmniejszyła masę ciała larw o 82%, pirytiostrobiny o 70%, a trifloksystrobiny, myklobutanilu i sangardu o około 30% (ryc. 1c).
Śmiertelność była najwyższa wśród larw karmionych pyłkiem kwiatowym traktowanym mankozebem, a następnie pirytiostrobiną i trifloksystrobiną. Śmiertelność wzrastała wraz ze wzrostem dawek mankozebu i pirytizoliny (ryc. 2; tabela 2). Jednakże śmiertelność stonki prosowianki wzrosła tylko nieznacznie wraz ze wzrostem stężenia trifloksystrobiny; cyprodynil i kaptan nie zwiększyły istotnie śmiertelności w porównaniu z preparatami kontrolnymi.
Porównano śmiertelność larw muchówek kukurydzianych po spożyciu pyłku potraktowanego oddzielnie sześcioma różnymi fungicydami. Mankozeb i pentopiramid były bardziej wrażliwe na doustne narażenie na larwy śmietek kukurydzianych (GLM: χ = 29,45, DF = 20, P = 0,0059) (linia, nachylenie = 0,29, P < 0,001; nachylenie = 0,24, P < 0,00)).
Średnio we wszystkich grupach leczenia 39,05% pacjentów stanowiły kobiety, a 60,95% mężczyźni. Wśród grup kontrolnych odsetek kobiet wyniósł 40% zarówno w badaniach z niską dawką (0,1X), jak i połową dawki (0,5X), oraz 30% w badaniach z dawką polową (1X). Przy dawce 0,1X, wśród larw karmionych pyłkiem, którym podawano mankozeb i myklobutanil, 33,33% osobników dorosłych stanowiły samice, 22% osobników dorosłych stanowiły samice, 44% dorosłych larw stanowiły samice, 44% dorosłych larw stanowiły samice, 41% dorosłych larw stanowiły samice, a w grupie kontrolnej odsetek ten wyniósł 31% (ryc. 3a). Przy dawce 0,5-krotnej, 33% dorosłych robaków w grupie mankozebu i pirytiostrobiny było samicami, 36% w grupie trifloksystrobiny, 41% w grupie myklobutanilu i 46% w grupie cyprostrobiny. Odsetek ten wynosił 53% w grupie kaptanu i 38% w grupie kontrolnej (ryc. 3b). Przy dawce 1X, 30% grupy mankozebu stanowiły kobiety, 36% w grupie pirytiostrobiny, 44% w grupie trifloksystrobiny, 38% w grupie myklobutanilu, 50% grupy kontrolnej stanowiły kobiety – 38,5% (ryc. 3c).
Procent samic i samców szkodników po narażeniu na działanie fungicydu w stadium larwalnym. (a) Niska dawka (0,1X). (b) Połowa dawki (0,5X). (c) Dawka polowa lub pełna dawka (1X).
Analiza sekwencji 16S wykazała, że grupa bakteryjna różniła się między larwami karmionymi pyłkiem kwiatowym traktowanym mankozebem a larwami karmionymi pyłkiem nietraktowanym (ryc. 4a). Wskaźnik mikrobiologiczny larw nietraktowanych, karmionych pyłkiem kwiatowym, był wyższy niż larw karmionych pyłkiem traktowanym mankozebem (ryc. 4b). Chociaż obserwowana różnica w bogactwie mikrobiomu między grupami nie była statystycznie istotna, była ona istotnie niższa niż obserwowana dla larw karmionych pyłkiem nietraktowanym (ryc. 4c). Względna liczebność mikrobiomu wykazała, że larwy karmione pyłkiem kontrolnym były bardziej zróżnicowane niż larwy karmione larwami traktowanymi mankozebem (ryc. 5a). Analiza opisowa ujawniła obecność 28 rodzajów mikrobiomu w próbkach kontrolnych i traktowanych mankozebem (ryc. 5b). c Analiza z wykorzystaniem sekwencjonowania 18S nie wykazała istotnych różnic (Rysunek uzupełniający 2).
Profile SAV oparte na sekwencjach 16S porównano z bogactwem Shannona i obserwowanym bogactwem na poziomie typu. (a) Analiza głównych współrzędnych (PCoA) oparta na ogólnej strukturze społeczności mikroorganizmów u larw karmionych pyłkiem, kontrolnych (niebieskie) i karmionych mankozebem (pomarańczowe). Każdy punkt danych reprezentuje oddzielną próbkę. PCoA obliczono za pomocą odległości Braya-Curtisa rozkładu t dla wielu zmiennych. Owale reprezentują 80% poziom ufności. (b) Wykres pudełkowy, surowe dane dotyczące bogactwa Shannona (punkty) i c. Bogactwo obserwowalne. Wykresy pudełkowe przedstawiają pola dla linii mediany, rozstępu międzykwartylowego (IQR) i 1,5 × IQR (n = 3).
Skład społeczności mikrobiologicznych larw karmionych pyłkiem traktowanym mankozebem i nietraktowanym. (a) Odczyty względnej liczebności rodzajów mikroorganizmów u larw. (b) Mapa cieplna zidentyfikowanych społeczności mikrobiologicznych. Delftia (iloraz szans (OR) = 0,67, P = 0,0030) i Pseudomonas (OR = 0,3, P = 0,0074), Microbacterium (OR = 0,75, P = 0,0617) (OR = 1,5, P = 0,0060); Wiersze mapy cieplnej są grupowane za pomocą odległości korelacyjnej i średniej łączności.
Nasze wyniki pokazują, że doustna ekspozycja na fungicydy kontaktowe (mankozeb) i systemiczne (pirostrobinę i trifloksystrobinę), powszechnie stosowane w okresie kwitnienia, znacząco zmniejszyła przyrost masy ciała i zwiększyła śmiertelność larw kukurydzy. Ponadto mankozeb znacząco zmniejszył różnorodność i bogactwo mikrobiomu w stadium przedpoczwarkowym. Myklobutanil, inny systemiczny fungicyd, znacząco zmniejszył przyrost masy ciała larw przy wszystkich trzech dawkach. Efekt ten był widoczny w drugim (5. dzień) i trzecim (8. dzień) punkcie czasowym. Natomiast cyprodynil i kaptan nie zmniejszyły znacząco przyrostu masy ciała ani przeżywalności w porównaniu z grupą kontrolną. Według naszej wiedzy, niniejsza praca jest pierwszą, w której określono wpływ dawek polowych różnych fungicydów stosowanych do ochrony upraw kukurydzy poprzez bezpośrednią ekspozycję na pyłek.
Wszystkie zabiegi fungicydowe znacząco zmniejszyły przyrost masy ciała w porównaniu z zabiegami kontrolnymi. Mankozeb miał największy wpływ na przyrost masy ciała larw, ze średnią redukcją o 51%, a następnie pirytiostrobina. Jednak inne badania nie wykazały negatywnego wpływu dawek fungicydów stosowanych w warunkach polowych na stadia larwalne44. Chociaż wykazano, że biocydy ditiokarbaminianowe charakteryzują się niską toksycznością ostrą45, bisditiokarbaminiany etylenu (EBDCS), takie jak mankozeb, mogą ulegać degradacji do siarczku etylenu (mocznika). Biorąc pod uwagę jego działanie mutagenne na inne zwierzęta, ten produkt degradacji może być odpowiedzialny za obserwowane efekty46,47. Wcześniejsze badania wykazały, że na powstawanie etylenotiomocznika wpływają takie czynniki, jak podwyższona temperatura48, poziom wilgotności49 i długość okresu przechowywania produktu50. Właściwe warunki przechowywania biocydów mogą łagodzić te skutki uboczne. Ponadto Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności wyraził obawy dotyczące toksyczności pirytiopidu, który okazał się rakotwórczy dla układu pokarmowego innych zwierząt51.
Doustne podanie mankozebu, pirytiostrobiny i trifloksystrobiny zwiększa śmiertelność larw stonki prosowianki. Natomiast myklobutanil, cyprocyklina i kaptan nie miały wpływu na śmiertelność. Wyniki te różnią się od wyników uzyskanych przez Ladurnera i in.52, którzy wykazali, że kaptan znacząco zmniejsza przeżywalność dorosłych osobników O. lignaria i Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apisidae). Ponadto stwierdzono, że fungicydy, takie jak kaptan i boskalid, powodują śmiertelność larw52,53,54 lub zmieniają ich zachowania żywieniowe55. Zmiany te z kolei mogą wpływać na jakość odżywczą pyłku, a ostatecznie na zysk energetyczny larw. Obserwowana śmiertelność w grupie kontrolnej była zgodna z wynikami innych badań56,57.
Obserwowany w naszej pracy korzystny dla samców stosunek płci można wyjaśnić czynnikami takimi jak niewystarczające krycie i niekorzystne warunki pogodowe podczas kwitnienia, co wcześniej sugerowali Vicens i Bosch w przypadku O. cornuta. Chociaż samice i samce w naszym badaniu miały cztery dni na krycie (okres powszechnie uważany za wystarczający do udanego krycia), celowo zmniejszyliśmy intensywność światła, aby zminimalizować stres. Jednak ta zmiana może nieumyślnie zakłócić proces krycia61. Ponadto pszczoły doświadczają kilku dni niekorzystnych warunków pogodowych, w tym deszczu i niskich temperatur (<5°C), co również może negatywnie wpływać na powodzenie krycia4,23.
Chociaż nasze badanie koncentrowało się na całym mikrobiomie larw, nasze wyniki dostarczają wglądu w potencjalne zależności między społecznościami bakteryjnymi, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla odżywiania pszczół i narażenia na fungicydy. Na przykład, larwy karmione pyłkiem potraktowanym mankozebem miały istotnie zmniejszoną strukturę i liczebność społeczności mikrobiologicznych w porównaniu z larwami karmionymi pyłkiem nietraktowanym. U larw spożywających pyłek nietraktowany, grupy bakterii Proteobacteria i Actinobacteria dominowały i były przeważnie tlenowe lub fakultatywnie tlenowe. Bakterie z Delft, zazwyczaj związane z gatunkami pszczół samotniczych, znane są z aktywności antybiotycznej, co wskazuje na potencjalną rolę ochronną przed patogenami. Inny gatunek bakterii, Pseudomonas, był liczny w larwach karmionych pyłkiem nietraktowanym, ale jego liczebność była istotnie zmniejszona w larwach traktowanych mankozebem. Nasze wyniki potwierdzają wcześniejsze badania identyfikujące Pseudomonas jako jeden z najliczniejszych rodzajów u O. bicornis35 i innych os samotniczych34. Chociaż nie zbadano dowodów eksperymentalnych na rolę Pseudomonas w zdrowiu O. cornifrons, wykazano, że bakteria ta promuje syntezę toksyn ochronnych u chrząszcza Paederus fuscipes oraz promuje metabolizm argininy in vitro 35, 65. Obserwacje te sugerują potencjalną rolę w obronie wirusowej i bakteryjnej podczas rozwoju larw O. cornifrons. Microbacterium to kolejny rodzaj zidentyfikowany w naszym badaniu, o którym donoszono, że występuje w dużych ilościach u larw muchy Black Soldier w warunkach głodu 66. U larw O. cornifrons mikrobakterie mogą przyczyniać się do równowagi i odporności mikrobiomu jelitowego w warunkach stresu. Ponadto, Rhodococcus występuje u larw O. cornifrons i jest znany ze swoich zdolności detoksykacyjnych 67. Ten rodzaj występuje również w jelitach A. florea, ale w bardzo małej liczebności 68. Nasze wyniki wskazują na obecność licznych wariantów genetycznych w licznych taksonach mikroorganizmów, które mogą wpływać na procesy metaboliczne u larw. Konieczne jest jednak lepsze zrozumienie różnorodności funkcjonalnej O. cornifrons.
Podsumowując, wyniki wskazują, że mankozeb, pirytiostrobina i trifloksystrobina zmniejszały przyrost masy ciała i zwiększały śmiertelność larw stonki prosowianki. Chociaż rosną obawy dotyczące wpływu fungicydów na zapylacze, istnieje potrzeba lepszego zrozumienia wpływu metabolitów resztkowych tych związków. Wyniki te można uwzględnić w zaleceniach dotyczących zintegrowanych programów zarządzania zapylaniem, które pomogą rolnikom unikać stosowania niektórych fungicydów przed i w trakcie kwitnienia drzew owocowych poprzez dobór fungicydów i zróżnicowanie terminów ich stosowania lub poprzez zachęcanie do stosowania mniej szkodliwych alternatyw36. Informacje te są istotne dla opracowania zaleceń dotyczących stosowania pestycydów, takich jak dostosowanie istniejących programów oprysków i zmiana terminów oprysków przy wyborze fungicydów lub promowanie stosowania mniej niebezpiecznych alternatyw. Konieczne są dalsze badania nad negatywnym wpływem fungicydów na proporcje płci, zachowania żywieniowe, mikrobiom jelitowy oraz mechanizmy molekularne leżące u podstaw utraty masy ciała i śmiertelności stonki prosowianki.
Dane źródłowe 1, 2 i 3 na rysunkach 1 i 2 zostały złożone w repozytorium danych figshare DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 i https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. Sekwencje analizowane w niniejszym badaniu (rysunki 4, 5) są dostępne w repozytorium NCBI SRA pod numerem akcesyjnym PRJNA1023565.
Bosch, J. i Kemp, WP Rozwój i ugruntowanie gatunków pszczół miodnych jako zapylaczy upraw rolnych: przykład rodzaju Osmia. (Hymenoptera: Megachilidae) i drzew owocowych. bull. Ntomore. resource. 92, 3–16 (2002).
Parker, MG i in. Praktyki zapylania i postrzeganie alternatywnych zapylaczy wśród plantatorów jabłek w Nowym Jorku i Pensylwanii. Aktualizacja. Rolnictwo. Systemy żywnościowe. 35, 1–14 (2020).
Koch I., Lonsdorf EW, Artz DR, Pitts-Singer TL i Ricketts TH Ekologia i ekonomika zapylania migdałów z wykorzystaniem rodzimych pszczół. J. Economics. Ntomore. 111, 16–25 (2018).
Lee, E., He, Y. i Park, Y.-L. Wpływ zmian klimatu na fenologię tragopanów: implikacje dla zarządzania populacją. Climb. Change 150, 305–317 (2018).
Artz, DR i Pitts-Singer, TL. Wpływ oprysków fungicydami i adiuwantami na zachowanie gniazdowania dwóch hodowanych pszczół samotnic (Osmia lignaria i Megachile rotundata). PloS One 10, e0135688 (2015).
Beauvais, S. i in. Niskotoksyczny fungicyd uprawny (fenbukonazol) zakłóca sygnały dotyczące jakości reprodukcji samców, co skutkuje zmniejszoną skutecznością kopulacji u dzikich pszczół samotnic. J. Apps. Ecology. 59, 1596–1607 (2022).
Sgolastra F. i in. Neonikotynoidowe insektycydy i biosynteza ergosterolu hamują synergistyczną śmiertelność wywołaną fungicydami u trzech gatunków pszczół. Zwalczanie szkodników. Nauka. 73, 1236–1243 (2017).
Kuhneman JG, Gillung J, Van Dyck MT, Fordyce RF. i Danforth BN Larwy os samotnych zmieniają różnorodność bakterii dostarczanych przez pyłek pszczołom Osmia cornifrons (Megachilidae) gniazdującym na łodygach. front. mikroorganizm. 13, 1057626 (2023).
Dharampal PS, Danforth BN i Steffan SA Ektosymbiotyczne mikroorganizmy w sfermentowanym pyłku są tak samo ważne dla rozwoju pszczół samotniczych jak sam pyłek. ekologia. ewolucja. 12. e8788 (2022).
Kelderer M, Manici LM, Caputo F i Thalheimer M. Sadzenie międzyrzędowe w sadach jabłoniowych w celu zwalczania chorób przesiewających: praktyczne badanie skuteczności oparte na wskaźnikach mikrobiologicznych. Plant Soil 357, 381–393 (2012).
Martin PL, Kravchik T., Khodadadi F., Achimovich SG i Peter KA Gorzka zgnilizna jabłoni w środkowoatlantyckich Stanach Zjednoczonych: ocena gatunków sprawczych oraz wpływu regionalnych warunków pogodowych i podatności odmian. Fitopatologia 111, 966–981 (2021).
Cullen MG, Thompson LJ, Carolan JK, Stout JK. i Stanley DA Fungicydy, herbicydy i pszczoły: przegląd systematyczny istniejących badań i metod. PLoS One 14, e0225743 (2019).
Pilling, ED i Jepson, PC Synergistyczne działanie fungicydów EBI i insektycydów pyretroidowych na pszczoły miodne (Apis mellifera). szkodniki nauka. 39, 293–297 (1993).
Mussen, EC, Lopez, JE i Peng, CY Wpływ wybranych fungicydów na wzrost i rozwój larw pszczoły miodnej Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae). Środa. Ntomore. 33, 1151-1154 (2004).
Van Dyke, M., Mullen, E., Wickstead, D. i McArt, S. Przewodnik decyzyjny dotyczący stosowania pestycydów w celu ochrony zapylaczy w sadach drzewiastych (Cornell University, 2018).
Iwasaki, JM i Hogendoorn, K. Narażenie pszczół na substancje inne niż pestycydy: przegląd metod i zgłoszonych wyników. Rolnictwo. Ekosystem. Środa. 314, 107423 (2021).
Kopit AM, Klinger E, Cox-Foster DL, Ramirez RA. i Pitts-Singer TL Wpływ rodzaju dostawy i narażenia na pestycydy na rozwój larw Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Środa. Ntomore. 51, 240–251 (2022).
Kopit AM i Pitts-Singer TL Drogi narażenia na pestycydy u samotnych pszczół z pustymi gniazdami. Środa. Ntomore. 47, 499–510 (2018).
Pan, NT i in. Nowy protokół biotestu połknięcia do oceny toksyczności pestycydów u dorosłych pszczół ogrodowych japońskich (Osmia cornifrons). Nauka. Reports 10, 9517 (2020).
Czas publikacji: 14 maja 2024 r.