Nicień sosnowy to migrujący pasożyt endopasożytniczy, który powoduje poważne straty ekonomiczne w ekosystemach lasów sosnowych. Niniejsze badanie analizuje aktywność nicieniobójczą halogenowanych indoli przeciwko nicieniom sosnowym i ich mechanizm działania. Aktywność nicieniobójcza 5-jodoindolu i awermektyny (kontrola pozytywna) przeciwko nicieniom sosnowym była podobna i wysoka przy niskich stężeniach (10 μg/ml). 5-jodoindol zmniejszał płodność, aktywność rozrodczą, śmiertelność zarodków i larw oraz zachowania lokomotoryczne. Interakcje molekularne ligandów z receptorami kanałów chlorkowych bramkowanych glutaminianem specyficznymi dla bezkręgowców potwierdzają pogląd, że 5-jodoindol, podobnie jak awermektyna, ściśle wiąże się z miejscem aktywnym receptora. 5-jodoindol indukował również różne deformacje fenotypowe u nicieni, w tym nieprawidłowe zapadanie się/kurczenie organów i zwiększoną wakuolizację. Wyniki te sugerują, że wakuole mogą odgrywać rolę w śmierci nicieni spowodowanej metylacją. Co ważne, 5-jodoindol nie był toksyczny dla obu gatunków roślin (kapusty i rzodkiewki). Zatem badanie to pokazuje, że stosowanie jodoindolu w warunkach środowiskowych może kontrolować uszkodzenia spowodowane więdnięciem sosny.
Nicień sosnowiec (Bursaphelenchus xylophilus) należy do nicieni sosnowców (PWN), migrujących nicieni endopasożytniczych, o których wiadomo, że powodują poważne szkody ekologiczne w ekosystemach lasów sosnowych1. Choroba więdnięcia sosny (PWD) wywoływana przez węgorza sosnowca staje się poważnym problemem na kilku kontynentach, w tym w Azji i Europie, a w Ameryce Północnej nicień niszczy introdukowane gatunki sosen1,2. Zamieranie sosen jest poważnym problemem ekonomicznym, a perspektywa jego globalnego rozprzestrzeniania się jest niepokojąca3. Następujące gatunki sosen są najczęściej atakowane przez nicienie: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii i Pinus radiata4. Nicień sosnowy to poważna choroba, która może zabić sosny w ciągu kilku tygodni lub miesięcy od zakażenia. Ponadto epidemie węgorka sosnowca są powszechne w wielu ekosystemach, co doprowadziło do powstania trwałych łańcuchów zakażeń1.
Bursaphelenchus xylophilus to nicień pasożytniczy roślin kwarantannowych należący do nadrodziny Aphelenchoidea i kladu 102.5. Nicień odżywia się grzybami i rozmnaża się w tkankach drewna sosnowego, rozwijając się w cztery różne stadia larwalne: L1, L2, L3, L4 i osobnik dorosły1,6. W warunkach niedoboru pożywienia nicień sosnowiec przechodzi w wyspecjalizowane stadium larwalne – dauer, które pasożytuje na swoim wektorze – korniku sosnowym (Monochamus alternatus) i jest przenoszone na zdrowe sosny. U zdrowych żywicieli nicienie szybko migrują przez tkanki roślinne i odżywiają się komórkami miękiszowymi, co prowadzi do szeregu reakcji nadwrażliwości, więdnięcia sosny i obumarcia w ciągu roku od zakażenia1,7,8.
Biologiczna kontrola nicieni sosnowych od dawna stanowi wyzwanie, a środki kwarantanny sięgają XX wieku. Obecne strategie kontroli nicieni sosnowych obejmują głównie zabiegi chemiczne, w tym fumigację drewna i implantację nematocydów do pni drzew. Najczęściej stosowanymi nematocydami są awermektyna i benzoesan awermektyny, które należą do rodziny awermektyn. Te drogie środki chemiczne są wysoce skuteczne przeciwko wielu gatunkom nicieni i są uważane za bezpieczne dla środowiska9. Jednak oczekuje się, że wielokrotne stosowanie tych nematocydów wywoła presję selekcyjną, która prawie na pewno doprowadzi do pojawienia się odpornych nicieni sosnowych, co wykazano w przypadku kilku szkodników owadzich, takich jak Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella oraz nicienie Trichostrongylus colubriformis i Ostertagia circumcincta, które stopniowo rozwinęły odporność na awermektyny10,11,12. Dlatego wzorce oporności muszą być regularnie badane, a nematocydy stale sprawdzane, aby znaleźć alternatywne, opłacalne i przyjazne dla środowiska środki kontroli PVD. W ostatnich dekadach wielu autorów zaproponowało stosowanie ekstraktów roślinnych, olejków eterycznych i substancji lotnych jako środków kontroli nicieni13,14,15,16.
Niedawno wykazaliśmy nicieniobójczą aktywność indolu, międzykomórkowej i międzykrólestwowej cząsteczki sygnałowej, u Caenorhabditis elegans 17 . Indol jest szeroko rozpowszechnionym wewnątrzkomórkowym sygnałem w ekologii mikroorganizmów, kontrolującym liczne funkcje, które wpływają na fizjologię mikroorganizmów, tworzenie zarodników, stabilność plazmidów, oporność na leki, tworzenie biofilmu i wirulencję 18, 19 . Aktywność indolu i jego pochodnych przeciwko innym nicieniom chorobotwórczym nie została zbadana. W tym badaniu zbadaliśmy nicieniobójczą aktywność 34 indoli przeciwko nicieniom sosnowym i wyjaśniliśmy mechanizm działania najsilniejszego 5-jodoindolu za pomocą mikroskopii, fotografii poklatkowej i eksperymentów dokowania molekularnego, a także oceniliśmy jego toksyczne działanie na rośliny za pomocą testu kiełkowania nasion.
Wcześniej donoszono, że wysokie stężenia indolu (>1,0 mM) mają działanie nicieniobójcze na nicienie17. Po leczeniu B. xylophilus (mieszane stadia rozwojowe) indolem lub 33 różnymi pochodnymi indolu w stężeniu 1 mM, śmiertelność B. xylophilus mierzono poprzez liczenie żywych i martwych nicieni w grupie kontrolnej i leczonej. Pięć indoli wykazało znaczącą aktywność nicieniobójczą; przeżycie nieleczonej grupy kontrolnej wyniosło 95 ± 7% po 24 h. Spośród 34 testowanych indoli, 5-jodoindol i 4-fluoroindol w stężeniu 1 mM powodowały 100% śmiertelność, podczas gdy 5,6-difluoroindygo, metyloindolo-7-karboksylan i 7-jodoindol powodowały około 50% śmiertelność (Tabela 1).
Wpływ 5-jodoindolu na powstawanie wakuoli i metabolizm nicienia sosnowca. (A) Wpływ awermektyny i 5-jodoindolu na dorosłe samce nicieni, (B) jaja nicieni w stadium L1 i (C) metabolizm B. xylophilus, (i) nie zaobserwowano wakuoli w godzinie 0, leczenie spowodowało (ii) powstanie wakuoli, (iii) nagromadzenie wielu wakuoli, (iv) pęcznienie wakuoli, (v) połączenie się wakuoli i (vi) utworzenie olbrzymich wakuoli. Czerwone strzałki wskazują na pęcznienie wakuoli, niebieskie strzałki wskazują na połączenie się wakuoli, a czarne strzałki wskazują na olbrzymie wakuole. Skala = 50 μm.
Ponadto w badaniu tym opisano również sekwencyjny proces śmierci wywołanej metanem u nicieni sosnowych (ryc. 4C). Śmierć metanogenna to nieapoptotyczny typ śmierci komórkowej związany z gromadzeniem się widocznych wakuoli cytoplazmatycznych27. Morfologiczne defekty obserwowane u nicieni sosnowych wydają się być ściśle związane z mechanizmem śmierci wywołanej metanem. Badanie mikroskopowe w różnych momentach wykazało, że olbrzymie wakuole powstały po 20 godzinach ekspozycji na 5-jodoindol (0,1 mM). Mikroskopijne wakuole zaobserwowano po 8 godzinach leczenia, a ich liczba wzrosła po 12 godzinach. Kilka dużych wakuoli zaobserwowano po 14 godzinach. Kilka połączonych wakuoli było wyraźnie widocznych po 12–16 godzinach leczenia, co wskazuje, że fuzja wakuoli jest podstawą mechanizmu śmierci metanogennej. Po 20 godzinach w całym robaku znaleziono kilka olbrzymich wakuoli. Obserwacje te stanowią pierwsze doniesienie o metuozie u C. elegans.
U robaków leczonych 5-jodoindolem obserwowano również agregację i pękanie wakuoli (Rys. 5), co potwierdzało zginanie robaka i uwalnianie wakuoli do środowiska. Zaburzenie wakuoli obserwowano również w błonie skorupy jaja, która jest normalnie zachowywana w stanie nienaruszonym przez L2 podczas wykluwania się (Rys. uzupełniający S2). Obserwacje te potwierdzają udział gromadzenia się płynu i niewydolności osmoregulacyjnej, a także odwracalnego uszkodzenia komórek (RCI) w procesie tworzenia i ropienia wakuoli (Rys. 5).
Stawiając hipotezę o roli jodu w obserwowanym tworzeniu się wakuoli, zbadaliśmy nicieniobójczą aktywność jodku sodu (NaI) i jodku potasu (KI). Jednak w stężeniach (0,1, 0,5 lub 1 mM) nie wpływały one ani na przeżycie nicieni, ani na tworzenie się wakuoli (Rys. uzupełniający S5), chociaż 1 mM KI miał niewielki efekt nicieniobójczy. Z drugiej strony 7-jodoindol (1 lub 2 mM), podobnie jak 5-jodoindol, indukował wiele wakuoli i deformacje strukturalne (Rys. uzupełniający S6). Dwa jodoindole wykazywały podobne cechy fenotypowe u nicieni sosnowych, podczas gdy NaI i KI nie. Co ciekawe, indol nie indukował tworzenia się wakuoli u B. xylophilus w testowanych stężeniach (dane nie pokazano). W ten sposób wyniki potwierdziły, że kompleks indolo-jodowy odpowiada za wakuolizację i metabolizm B. xylophilus.
Spośród indoli badanych pod kątem aktywności nicieniobójczej, 5-jodoindol miał najwyższy wskaźnik poślizgu wynoszący -5,89 kcal/mol, następnie 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) i indol (-4,03) ( Rysunek 6 ). Silne wiązanie wodorowe szkieletu 5-jodoindolu z leucyną 218 stabilizuje jego wiązanie, podczas gdy wszystkie inne pochodne indolu wiążą się z seryną 260 za pośrednictwem wiązań wodorowych łańcucha bocznego. Spośród innych modelowanych jodoindoli, 2-jodoindol ma wartość wiązania wynoszącą -5,248 kcal/mol, co wynika z jego głównego wiązania wodorowego z leucyną 218. Inne znane wiązania obejmują 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) i 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (Rysunek uzupełniający S8). Większość halogenowanych indoli i sam indol, z wyjątkiem 5-jodoindolu i 2-jodoindolu, tworzą wiązanie z seryną 260. Fakt, że wiązanie wodorowe z leucyną 218 wskazuje na efektywne wiązanie receptor-ligand, jak zaobserwowano w przypadku iwermektyny (Rys. uzupełniający S7), potwierdza, że 5-jodoindol i 2-jodoindol, podobnie jak iwermektyna, ściśle wiążą się z miejscem aktywnym receptora GluCL poprzez leucynę 218 (Rys. 6 i Rys. uzupełniający S8). Proponujemy, że to wiązanie jest wymagane do utrzymania otwartej struktury porów kompleksu GluCL i że poprzez ścisłe wiązanie się z miejscem aktywnym receptora GluCL, 5-jodoindol, 2-jodoindol, awermektyna i iwermektyna utrzymują kanał jonowy otwarty i umożliwiają wychwyt płynu.
Dokowanie molekularne indolu i halogenowanego indolu do GluCL. Orientacje wiązania ligandów (A) indolu, (B) 4-fluoroindolu, (C) 7-jodoindolu i (D) 5-jodoindolu do miejsca aktywnego GluCL. Białko jest przedstawione za pomocą wstążki, a wiązania wodorowe szkieletu są pokazane jako żółte linie przerywane. (A′), (B′), (C′) i (D′) pokazują interakcje odpowiednich ligandów z otaczającymi resztami aminokwasów, a wiązania wodorowe łańcucha bocznego są oznaczone różowymi strzałkami przerywanymi.
Przeprowadzono eksperymenty w celu oceny toksycznego wpływu 5-jodoindolu na kiełkowanie nasion kapusty i rzodkiewki. 5-jodoindol (0,05 lub 0,1 mM) lub awermektyna (10 μg/ml) miały niewielki lub żaden wpływ na początkowe kiełkowanie i wschodzenie sadzonek (rysunek 7). Ponadto nie stwierdzono istotnej różnicy między szybkością kiełkowania nieleczonych kontroli i nasion traktowanych 5-jodoindolem lub awermektyną. Wpływ na wydłużanie się korzenia palowego i liczbę utworzonych korzeni bocznych był nieistotny, chociaż 1 mM (10-krotność stężenia aktywnego) 5-jodoindolu nieznacznie opóźniło rozwój korzeni bocznych. Wyniki te wskazują, że 5-jodoindol jest nietoksyczny dla komórek roślinnych i nie zakłóca procesów rozwoju roślin w badanych stężeniach.
Wpływ 5-jodoindolu na kiełkowanie nasion. Kiełkowanie, wyrastanie i boczne ukorzenianie nasion B. oleracea i R. raphanistrum na podłożu agarowym Murashige i Skoog z dodatkiem lub bez dodatku awermektyny lub 5-jodoindolu. Kiełkowanie odnotowano po 3 dniach inkubacji w temperaturze 22°C.
W tym badaniu opisano kilka przypadków zabijania nicieni przez indole. Co ważne, jest to pierwszy raport o metylacji indukowanej jodoindolem (proces spowodowany gromadzeniem się małych wakuoli, które stopniowo łączą się w gigantyczne wakuole, co ostatecznie prowadzi do pęknięcia błony i śmierci) w igłach sosnowych, przy czym jodoindol wykazuje znaczące właściwości nicieniobójcze podobne do właściwości komercyjnego nicieniobójczego awermektyny.
Donoszono już, że indole wywierają wiele funkcji sygnałowych u prokariotów i eukariotów, w tym hamowanie/tworzenie biofilmu, przeżywalność bakterii i patogeniczność19,32,33,34. Ostatnio potencjalne efekty terapeutyczne halogenowanych indoli, alkaloidów indolowych i półsyntetycznych pochodnych indolowych przyciągnęły szerokie zainteresowanie badawcze35,36,37. Na przykład wykazano, że halogenowane indole zabijają trwałe komórki Escherichia coli i Staphylococcus aureus37. Ponadto, naukowe jest zbadanie skuteczności halogenowanych indoli przeciwko innym gatunkom, rodzajom i królestwom, a niniejsze badanie jest krokiem w kierunku osiągnięcia tego celu.
W niniejszym artykule proponujemy mechanizm śmiertelności wywołanej 5-jodoindolem u C. elegans w oparciu o odwracalne uszkodzenie komórek (RCI) i metylację (rysunki 4C i 5). Zmiany obrzękowe, takie jak opuchlizna i zwyrodnienie wakuolarne, są wskaźnikami RCI i metylacji, objawiającymi się jako olbrzymie wakuole w cytoplazmie48,49. RCI zakłóca produkcję energii poprzez redukcję produkcji ATP, powodując awarię pompy ATPazy lub zakłócając błony komórkowe i powodując szybki napływ jonów Na+, Ca2+ i wody50,51,52. Wakuole wewnątrzcytoplazmatyczne powstają w komórkach zwierzęcych w wyniku gromadzenia się płynu w cytoplazmie z powodu napływu jonów Ca2+ i wody53. Co ciekawe, ten mechanizm uszkodzenia komórek jest odwracalny, jeśli uszkodzenie jest tymczasowe, a komórki zaczynają produkować ATP przez pewien okres czasu, ale jeśli uszkodzenie utrzymuje się lub pogłębia, komórki obumierają.54 Nasze obserwacje pokazują, że nicienie poddane działaniu 5-jodoindolu nie są w stanie przywrócić normalnej biosyntezy po narażeniu na warunki stresowe.
Fenotyp metylacji indukowany przez 5-jodoindol w B. xylophilus może być spowodowany obecnością jodu i jego rozkładem molekularnym, ponieważ 7-jodoindol miał mniejszy efekt hamujący na B. xylophilus niż 5-jodoindol (Tabela 1 i Rysunek uzupełniający S6). Wyniki te są częściowo zgodne z badaniami Maltese i in. (2014), którzy donieśli, że translokacja pirydylowej reszty azotowej w indolu z pozycji para- do pozycji meta- zniosła wakuolizację, zahamowanie wzrostu i cytotoksyczność w komórkach U251, co sugeruje, że interakcja cząsteczki ze specyficznym miejscem aktywnym w białku ma kluczowe znaczenie27,44,45. Interakcje między indolem lub halogenowanymi indolami i receptorami GluCL zaobserwowane w tym badaniu również potwierdzają tę koncepcję, ponieważ stwierdzono, że 5- i 2-jodoindol wiążą się z receptorami GluCL silniej niż inne badane indole (Rysunek 6 i Rysunek uzupełniający S8). Stwierdzono, że jod w drugiej lub piątej pozycji indolu wiąże się z leucyną 218 receptora GluCL poprzez wiązania wodorowe szkieletu, podczas gdy inne halogenowane indole i sam indol tworzą słabe wiązania wodorowe łańcucha bocznego z seryną 260 (Rysunek 6). Dlatego też spekulujemy, że lokalizacja halogenu odgrywa ważną rolę w indukcji degeneracji wakuolarnej, podczas gdy ścisłe wiązanie 5-jodoindolu utrzymuje kanał jonowy otwarty, umożliwiając tym samym szybki napływ płynu i pęknięcie wakuoli. Jednak szczegółowy mechanizm działania 5-jodoindolu pozostaje do ustalenia.
Przed praktycznym zastosowaniem 5-jodoindolu należy przeanalizować jego toksyczny wpływ na rośliny. Nasze eksperymenty kiełkowania nasion wykazały, że 5-jodoindol nie miał negatywnego wpływu na kiełkowanie nasion ani późniejsze procesy rozwojowe przy badanych stężeniach (rysunek 7). Tak więc badanie to stanowi podstawę do stosowania 5-jodoindolu w środowisku ekologicznym w celu kontrolowania szkodliwości nicieni sosnowych dla drzew sosnowych.
Poprzednie raporty wykazały, że terapia oparta na indolu stanowi potencjalne podejście do rozwiązania problemu oporności na antybiotyki i postępu raka55. Ponadto indole posiadają właściwości przeciwbakteryjne, przeciwnowotworowe, przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwcukrzycowe, przeciwwirusowe, przeciwproliferacyjne i przeciwgruźlicze i mogą stanowić obiecującą podstawę do opracowywania leków56,57. Badanie to po raz pierwszy sugeruje potencjalne zastosowanie jodu jako środka przeciwpasożytniczego i przeciwrobaczego.
Awermektyna została odkryta trzy dekady temu i zdobyła Nagrodę Nobla w 2015 r., a jej stosowanie jako środka przeciwrobaczego jest nadal aktywne. Jednak ze względu na szybki rozwój oporności na awermektyny u nicieni i szkodników owadzich, potrzebna jest alternatywna, niedroga i przyjazna dla środowiska strategia zwalczania infekcji PWN u sosen. W badaniu tym opisano również mechanizm, za pomocą którego 5-jodoindol zabija nicienie sosnowe, a także fakt, że 5-jodoindol ma niską toksyczność dla komórek roślinnych, co otwiera dobre perspektywy dla jego przyszłego zastosowania komercyjnego.
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Uniwersytetu Yeungnam w Gyeongsan w Korei, a metody przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komisji Etycznej Uniwersytetu Yeungnam.
Eksperymenty inkubacji jaj przeprowadzono przy użyciu ustalonych procedur43. Aby ocenić wskaźniki wylęgu (HR), 1-dniowe dorosłe nicienie (około 100 samic i 100 samców) przeniesiono do szalek Petriego zawierających grzyby i pozostawiono do wzrostu na 24 godziny. Następnie jaja wyizolowano i potraktowano 5-jodoindolem (0,05 mM i 0,1 mM) lub awermektyną (10 μg/ml) w postaci zawiesiny w sterylnej wodzie destylowanej. Te zawiesiny (500 μl; około 100 jaj) przeniesiono do dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubowano w temperaturze 22 °C. Liczbę L2 sporządzono po 24 godzinach inkubacji, ale uznano je za martwe, jeśli komórki nie poruszały się po stymulacji cienkim platynowym drutem. Eksperyment przeprowadzono w dwóch etapach, każdy z sześcioma powtórzeniami. Dane z obu eksperymentów połączono i przedstawiono. Procent HR oblicza się następująco:
Śmiertelność larw oceniano przy użyciu wcześniej opracowanych procedur. Jaja nicieni zebrano, a zarodki zsynchronizowano poprzez wyklucie się w sterylnej wodzie destylowanej w celu wytworzenia larw w stadium L2. Zsynchronizowane larwy (około 500 nicieni) potraktowano 5-jodoindolem (0,05 mM i 0,1 mM) lub awermektyną (10 μg/ml) i hodowano na płytkach Petriego B. cinerea. Po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 22 °C nicienie zebrano w sterylnej wodzie destylowanej i zbadano pod kątem obecności stadiów L2, L3 i L4. Obecność stadiów L3 i L4 wskazywała na transformację larwalną, podczas gdy obecność stadia L2 wskazywała na brak transformacji. Obrazy uzyskano przy użyciu systemu cyfrowego obrazowania komórek iRiS™. Eksperyment przeprowadzono w dwóch etapach, każdy z sześcioma powtórzeniami. Dane z obu eksperymentów połączono i przedstawiono.
Toksyczność 5-jodoindolu i awermektyny dla nasion oceniano za pomocą testów kiełkowania na płytkach agarowych Murashige i Skoog.62 Nasiona B. oleracea i R. raphanistrum moczono najpierw w sterylnej wodzie destylowanej przez jeden dzień, przemywano 1 ml 100% etanolu, sterylizowano 1 ml 50% komercyjnego wybielacza (3% podchlorynu sodu) przez 15 min i przemywano pięć razy 1 ml sterylnej wody. Następnie sterylizowane nasiona prasowano na płytkach agarowych do kiełkowania zawierających 0,86 g/l (0,2X) podłoża Murashige i Skoog oraz 0,7% agaru bakteriologicznego z 5-jodoindolem lub awermektyną lub bez nich. Następnie płytki inkubowano w temperaturze 22 °C, a zdjęcia wykonywano po 3 dniach inkubacji. Eksperyment przeprowadzono w dwóch etapach, z których każdy obejmował sześć powtórzeń.
Czas publikacji: 26-02-2025