Węgorz sosnowy to migrujący pasożyt endopasożyt kwarantannowy, o którym wiadomo, że powoduje poważne straty ekonomiczne w ekosystemach lasów sosnowych. W niniejszym badaniu dokonano przeglądu aktywności nicieniobójczej halogenowanych indoli wobec węgorzyków sosnowych oraz mechanizmu ich działania. Aktywność nicieniobójcza 5-jodoindolu i awermektyny (kontrola pozytywna) wobec węgorzyków sosnowych była podobna i wysoka przy niskich stężeniach (10 μg/ml). 5-jodoindol zmniejszał płodność, aktywność rozrodczą, śmiertelność zarodków i larw oraz zachowania lokomotoryczne. Interakcje molekularne ligandów z receptorami kanałów chlorkowych bramkowanych glutaminianem, specyficznymi dla bezkręgowców, potwierdzają hipotezę, że 5-jodoindol, podobnie jak awermektyna, ściśle wiąże się z miejscem aktywnym receptora. 5-jodoindol indukował również różne deformacje fenotypowe u nicieni, w tym nieprawidłowe zapadanie się/kurczenie organów i zwiększoną wakuolizację. Wyniki te sugerują, że wakuole mogą odgrywać rolę w obumieraniu nicieni w wyniku metylacji. Co ważne, 5-jodoindol nie był toksyczny dla obu gatunków roślin (kapusty i rzodkiewki). Zatem niniejsze badanie dowodzi, że zastosowanie jodoindolu w warunkach środowiskowych może kontrolować uszkodzenia spowodowane więdnięciem sosny.
Węgorek sosnowiec (Bursaphelenchus xylophilus) należy do węgorków sosnowców (PWN), migrujących nicieni endopasożytniczych, o których wiadomo, że powodują poważne szkody ekologiczne w ekosystemach lasów sosnowych1. Choroba więdnięcia sosny (PWD) wywoływana przez węgorka sosnowca staje się poważnym problemem na kilku kontynentach, w tym w Azji i Europie, a w Ameryce Północnej nicień niszczy introdukowane gatunki sosny1,2. Zamieranie sosen jest poważnym problemem ekonomicznym, a perspektywa jego globalnego rozprzestrzeniania się jest niepokojąca3. Następujące gatunki sosny są najczęściej atakowane przez nicienie: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii i Pinus radiata4. Węgorek sosnowy to poważna choroba, która może zabić sosny w ciągu kilku tygodni lub miesięcy od zakażenia. Ponadto epidemie węgorka sosnowca zdarzają się często w wielu ekosystemach, co doprowadziło do powstania trwałych łańcuchów zakażeń1.
Bursaphelenchus xylophilus to nicień pasożytujący na roślinach kwarantannowych, należący do nadrodziny Aphelenchoidea i kladu 102.5. Nicień ten odżywia się grzybami i rozmnaża się w tkankach drzew sosny, rozwijając się w cztery różne stadia larwalne: L1, L2, L3, L4 oraz osobnik dorosły1,6. W warunkach niedoboru pożywienia węgorek sosnowiec przechodzi w wyspecjalizowane stadium larwalne – dauer, które pasożytuje na swoim wektorze – korniku sosnowcu (Monochamus alternatus) i jest przenoszone na zdrowe drzewa sosnowe. U zdrowych żywicieli nicienie szybko migrują przez tkanki roślinne i żerują na komórkach parenchymatycznych, co prowadzi do szeregu reakcji nadwrażliwości, więdnięcia sosny i jej obumarcia w ciągu roku od zakażenia1,7,8.
Biologiczna kontrola węgorka sosnowego od dawna stanowi wyzwanie, a środki kwarantanny sięgają XX wieku. Obecne strategie zwalczania węgorka sosnowego obejmują głównie zabiegi chemiczne, w tym fumigację drewna i implantację nematocydów do pni drzew. Najczęściej stosowanymi nematocydami są awermektyna i benzoesan awermektyny, należące do rodziny awermektyn. Te drogie środki chemiczne są wysoce skuteczne przeciwko wielu gatunkom nicieni i są uważane za bezpieczne dla środowiska9. Oczekuje się jednak, że wielokrotne stosowanie tych nematocydów wywoła presję selekcyjną, która prawie na pewno doprowadzi do pojawienia się odpornych węgorków sosnowych, co wykazano w przypadku kilku szkodników owadzich, takich jak Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella oraz nicienie Trichostrongylus colubriformis i Ostertagia circumcincta, które stopniowo rozwinęły oporność na awermektyny10,11,12. W związku z tym konieczne jest regularne badanie wzorców oporności i ciągła kontrola nicieni w celu znalezienia alternatywnych, opłacalnych i przyjaznych dla środowiska metod zwalczania PVD. W ostatnich dekadach wielu autorów zaproponowało stosowanie ekstraktów roślinnych, olejków eterycznych i substancji lotnych jako środków zwalczających nicienie13,14,15,16.
Niedawno zademonstrowaliśmy nicieniobójczą aktywność indolu, międzykomórkowej i międzykrólestwowej cząsteczki sygnałowej, u Caenorhabditis elegans17. Indol jest szeroko rozpowszechnionym wewnątrzkomórkowym sygnałem w ekologii mikroorganizmów, kontrolującym liczne funkcje wpływające na fizjologię drobnoustrojów, tworzenie zarodników, stabilność plazmidów, lekooporność, tworzenie biofilmu i wirulencję18, 19. Aktywność indolu i jego pochodnych wobec innych patogennych nicieni nie była badana. W niniejszym badaniu zbadaliśmy nicieniobójczą aktywność 34 indoli wobec nicieni sosnowych i wyjaśniliśmy mechanizm działania najsilniejszego 5-jodoindolu, wykorzystując mikroskopię, fotografię poklatkową i eksperymenty dokowania molekularnego, a także oceniliśmy jego toksyczny wpływ na rośliny za pomocą testu kiełkowania nasion.
Wysokie stężenia indolu (>1,0 mM) wykazywały wcześniej działanie nicieniobójcze na nicienie17. Po leczeniu B. xylophilus (mieszane stadia rozwojowe) indolem lub 33 różnymi pochodnymi indolu w stężeniu 1 mM, śmiertelność B. xylophilus mierzono, licząc żywe i martwe nicienie w grupie kontrolnej i leczonej. Pięć indoli wykazało znaczącą aktywność nicieniobójczą; przeżywalność nieleczonej grupy kontrolnej wyniosła 95 ± 7% po 24 godzinach. Spośród 34 testowanych indoli, 5-jodoindol i 4-fluoroindol w stężeniu 1 mM powodowały 100% śmiertelność, podczas gdy 5,6-difluoroindygo, metyloindolo-7-karboksylan i 7-jodoindol powodowały około 50% śmiertelność (Tabela 1).
Wpływ 5-jodoindolu na tworzenie i metabolizm wakuoli u węgorka sosnowca. (A) Wpływ awermektyny i 5-jodoindolu na dorosłe samce nicieni, (B) jaja nicieni w stadium L1 oraz (C) metabolizm B. xylophilus, (i) nie zaobserwowano wakuoli po godzinie 0, leczenie spowodowało (ii) tworzenie się wakuoli, (iii) akumulację wielu wakuoli, (iv) pęcznienie wakuoli, (v) łączenie się wakuoli i (vi) tworzenie się olbrzymich wakuoli. Czerwone strzałki oznaczają pęcznienie wakuoli, niebieskie – łączenie się wakuoli, a czarne – olbrzymie wakuole. Podziałka = 50 μm.
Ponadto, w badaniu tym opisano również sekwencyjny proces śmierci wywołanej metanem u nicieni sosnowych (Rysunek 4C). Śmierć metanogenna to nieapoptotyczny typ śmierci komórkowej związany z akumulacją widocznych wakuoli cytoplazmatycznych27. Morfologiczne defekty obserwowane u nicieni sosnowych wydają się być ściśle związane z mechanizmem śmierci wywołanej metanem. Badanie mikroskopowe w różnych momentach wykazało, że olbrzymie wakuole powstały po 20 godzinach ekspozycji na 5-jodoindol (0,1 mM). Mikroskopijne wakuole obserwowano po 8 godzinach ekspozycji, a ich liczba wzrosła po 12 godzinach. Kilka dużych wakuoli zaobserwowano po 14 godzinach. Kilka zrośniętych wakuoli było wyraźnie widocznych po 12–16 godzinach ekspozycji, co wskazuje, że fuzja wakuoli jest podstawą mechanizmu śmierci metanogennej. Po 20 godzinach w całym robaku znaleziono kilka olbrzymich wakuoli. Obserwacje te stanowią pierwsze doniesienie o metuozie u C. elegans.
U robaków leczonych 5-jodoindolem obserwowano również agregację i pękanie wakuoli (ryc. 5), o czym świadczyło zginanie się robaka i uwalnianie wakuoli do środowiska. Zaobserwowano również przerwanie ciągłości wakuoli w błonie skorupy jaja, która normalnie jest nienaruszona przez L2 podczas wykluwania się (rys. uzupełniający S2). Obserwacje te potwierdzają udział gromadzenia się płynu i zaburzeń osmoregulacji, a także odwracalnego uszkodzenia komórek (RCI) w procesie tworzenia i ropienia wakuoli (ryc. 5).
Stawiając hipotezę o roli jodu w obserwowanym tworzeniu wakuoli, zbadaliśmy nicieniobójczą aktywność jodku sodu (NaI) i jodku potasu (KI). Jednakże w stężeniach (0,1, 0,5 lub 1 mM) nie wpływały one ani na przeżywalność nicieni, ani na tworzenie wakuoli (Rys. uzupełniający S5), chociaż 1 mM KI wykazywało niewielkie działanie nicieniobójcze. Z drugiej strony, 7-jodoindol (1 lub 2 mM), podobnie jak 5-jodoindol, indukował powstawanie wielu wakuoli i deformacje strukturalne (Rys. uzupełniający S6). Oba jodoindole wykazywały podobne cechy fenotypowe u nicieni sosnowych, podczas gdy NaI i KI nie wykazywały takich cech. Co ciekawe, indol nie indukował tworzenia wakuoli u B. xylophilus w testowanych stężeniach (dane nieprzedstawione). W ten sposób wyniki potwierdziły, że kompleks indolo-jodowy odpowiada za wakuolizację i metabolizm B. xylophilus.
Spośród indoli badanych pod kątem aktywności nicieniobójczej, 5-jodoindol miał najwyższy współczynnik poślizgu, wynoszący -5,89 kcal/mol, następnie 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) i indol (-4,03) (ryc. 6). Silne wiązanie wodorowe szkieletu 5-jodoindolu z leucyną 218 stabilizuje jego wiązanie, podczas gdy wszystkie inne pochodne indolu wiążą się z seryną 260 poprzez wiązania wodorowe w łańcuchach bocznych. Spośród innych modelowanych jodoindoli, 2-jodoindol ma wartość wiązania wynoszącą -5,248 kcal/mol, co wynika z jego głównego wiązania wodorowego z leucyną 218. Inne znane wiązania obejmują 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) i 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (Rysunek uzupełniający S8). Większość halogenowanych indoli i sam indol, z wyjątkiem 5-jodoindolu i 2-jodoindolu, tworzą wiązanie z seryną 260. Fakt, że wiązanie wodorowe z leucyną 218 świadczy o efektywnym wiązaniu receptor-ligand, jak zaobserwowano w przypadku iwermektyny (Rys. uzupełniający S7), potwierdza, że 5-jodoindol i 2-jodoindol, podobnie jak iwermektyna, ściśle wiążą się z miejscem aktywnym receptora GluCL poprzez leucynę 218 (Rys. 6 i Rys. uzupełniający S8). Sugerujemy, że to wiązanie jest niezbędne do utrzymania otwartej struktury porów kompleksu GluCL i że poprzez ścisłe wiązanie z miejscem aktywnym receptora GluCL, 5-jodoindol, 2-jodoindol, awermektyna i iwermektyna utrzymują w ten sposób otwarty kanał jonowy i umożliwiają wychwyt płynów.
Dokowanie molekularne indolu i halogenowanego indolu do GluCL. Orientacje wiązania ligandów (A) indolu, (B) 4-fluoroindolu, (C) 7-jodoindolu i (D) 5-jodoindolu do miejsca aktywnego GluCL. Białko jest przedstawione za pomocą wstążki, a wiązania wodorowe szkieletu są pokazane żółtymi liniami przerywanymi. (A′), (B′), (C′) i (D′) pokazują interakcje odpowiednich ligandów z otaczającymi resztami aminokwasowymi, a wiązania wodorowe w łańcuchach bocznych są oznaczone różowymi strzałkami przerywanymi.
Przeprowadzono eksperymenty w celu oceny toksycznego wpływu 5-jodoindolu na kiełkowanie nasion kapusty i rzodkiewki. 5-jodoindol (0,05 lub 0,1 mM) lub awermektyna (10 μg/ml) miały niewielki lub żaden wpływ na kiełkowanie początkowe i wschody sadzonek (ryc. 7). Ponadto nie stwierdzono istotnej różnicy między szybkością kiełkowania nasion kontrolnych niepoddanych działaniu substancji a nasionami poddanymi działaniu 5-jodoindolu lub awermektyny. Wpływ na wydłużanie się korzenia palowego i liczbę utworzonych korzeni bocznych był nieistotny, chociaż 1 mM (10-krotność stężenia substancji czynnej) 5-jodoindolu nieznacznie opóźniło rozwój korzeni bocznych. Wyniki te wskazują, że 5-jodoindol nie jest toksyczny dla komórek roślinnych i nie zakłóca procesów rozwojowych roślin w badanych stężeniach.
Wpływ 5-jodoindolu na kiełkowanie nasion. Kiełkowanie, wzrost i ukorzenianie boczne nasion B. oleracea i R. raphanistrum na podłożu agarowym Murashige i Skooga z dodatkiem lub bez dodatku awermektyny lub 5-jodoindolu. Kiełkowanie mierzono po 3 dniach inkubacji w temperaturze 22°C.
W niniejszym badaniu opisano kilka przypadków zabicia nicieni przez indole. Co ważne, jest to pierwsze doniesienie o metylacji indukowanej jodoindolem (proces spowodowany gromadzeniem się małych wakuoli, które stopniowo łączą się w gigantyczne wakuole, prowadząc ostatecznie do pęknięcia błony komórkowej i obumarcia) w igłach sosny. Jodoindol wykazuje znaczące właściwości nicieniobójcze, podobne do właściwości komercyjnego nicieniobójcy, awermektyny.
Donoszono już, że indole pełnią wiele funkcji sygnałowych u prokariontów i eukariontów, w tym hamowanie/tworzenie biofilmu, przeżywalność bakterii i patogenność19,32,33,34. Ostatnio potencjalne działanie terapeutyczne halogenowanych indoli, alkaloidów indolowych i półsyntetycznych pochodnych indolu wzbudziło szerokie zainteresowanie badawcze35,36,37. Na przykład, wykazano, że halogenowane indole zabijają przetrwałe komórki Escherichia coli i Staphylococcus aureus37. Ponadto, z naukowego punktu widzenia interesujące jest zbadanie skuteczności halogenowanych indoli przeciwko innym gatunkom, rodzajom i królestwom, a niniejsze badanie stanowi krok w kierunku osiągnięcia tego celu.
W niniejszym artykule proponujemy mechanizm letalności indukowanej 5-jodoindolem u C. elegans, oparty na odwracalnym uszkodzeniu komórek (RCI) i metylacji (ryciny 4C i 5). Zmiany obrzękowe, takie jak opuchlizna i zwyrodnienie wodniczkowe, są wskaźnikami RCI i metylacji, objawiającymi się obecnością olbrzymich wakuoli w cytoplazmie48,49. RCI zakłóca produkcję energii, zmniejszając produkcję ATP, powodując niewydolność pompy ATP-azy lub uszkadzając błony komórkowe i powodując szybki napływ jonów Na+, Ca2+ i wody50,51,52. Wakuole wewnątrzcytoplazmatyczne powstają w komórkach zwierzęcych w wyniku gromadzenia się płynu w cytoplazmie na skutek napływu jonów Ca2+ i wody53. Co ciekawe, ten mechanizm uszkadzania komórek jest odwracalny, jeżeli uszkodzenie jest tymczasowe, a komórki zaczynają produkować ATP przez pewien czas, ale jeżeli uszkodzenie utrzymuje się lub pogłębia, komórki obumierają.54 Nasze obserwacje pokazują, że nicienie poddane działaniu 5-jodoindolu nie są w stanie przywrócić normalnej biosyntezy po narażeniu na warunki stresowe.
Fenotyp metylacji indukowany przez 5-jodoindol u B. xylophilus może wynikać z obecności jodu i jego dystrybucji molekularnej, ponieważ 7-jodoindol miał mniejszy efekt hamujący na B. xylophilus niż 5-jodoindol (Tabela 1 i Rysunek uzupełniający S6). Wyniki te są częściowo zgodne z badaniami Maltese i in. (2014), którzy donieśli, że translokacja pirydylowej reszty azotowej w indolu z pozycji para do pozycji meta znosiła wakuolizację, zahamowanie wzrostu i cytotoksyczność w komórkach U251, co sugeruje, że interakcja cząsteczki ze specyficznym miejscem aktywnym w białku ma kluczowe znaczenie27,44,45. Interakcje między indolem lub halogenowanymi indolami a receptorami GluCL obserwowane w tym badaniu również potwierdzają tę tezę, ponieważ stwierdzono, że 5- i 2-jodoindol wiążą się z receptorami GluCL silniej niż inne badane indole (rycina 6 i rycina uzupełniająca S8). Stwierdzono, że jod w drugiej lub piątej pozycji indolu wiąże się z leucyną 218 receptora GluCL poprzez szkieletowe wiązania wodorowe, podczas gdy inne halogenowane indole i sam indol tworzą słabe wiązania wodorowe w łańcuchach bocznych z seryną 260 (rycina 6). W związku z tym spekulujemy, że lokalizacja halogenu odgrywa ważną rolę w indukcji degeneracji wakuolarnej, podczas gdy ścisłe wiązanie 5-jodoindolu utrzymuje kanał jonowy otwarty, umożliwiając tym samym szybki napływ płynu i pękanie wakuoli. Jednak szczegółowy mechanizm działania 5-jodoindolu pozostaje do ustalenia.
Przed praktycznym zastosowaniem 5-jodoindolu należy przeanalizować jego toksyczny wpływ na rośliny. Nasze eksperymenty z kiełkowaniem nasion wykazały, że 5-jodoindol nie miał negatywnego wpływu na kiełkowanie nasion ani na późniejsze procesy rozwojowe w badanych stężeniach (rysunek 7). Zatem niniejsze badanie stanowi podstawę do zastosowania 5-jodoindolu w środowisku ekologicznym w celu ograniczenia szkodliwości węgorków sosnowych dla sosen.
Poprzednie raporty wykazały, że terapia oparta na indolu stanowi potencjalne podejście do rozwiązania problemu oporności na antybiotyki i progresji nowotworów.55 Ponadto indole posiadają działanie przeciwbakteryjne, przeciwnowotworowe, antyoksydacyjne, przeciwzapalne, przeciwcukrzycowe, przeciwwirusowe, antyproliferacyjne i przeciwgruźlicze i mogą stanowić obiecującą podstawę do rozwoju leków.56,57 Niniejsze badanie po raz pierwszy sugeruje potencjalne zastosowanie jodu jako środka przeciwpasożytniczego i przeciwrobaczego.
Awermektyna została odkryta trzy dekady temu i w 2015 roku otrzymała Nagrodę Nobla, a jej zastosowanie jako środka przeciwrobaczego jest nadal aktywne. Jednak ze względu na szybki rozwój oporności nicieni i szkodników owadzich na awermektyny, potrzebna jest alternatywna, tania i przyjazna dla środowiska strategia zwalczania infekcji węgorkiem sosnowym u sosen. W niniejszym badaniu opisano również mechanizm, za pomocą którego 5-jodoindol zabija węgorki sosnowe, oraz fakt, że 5-jodoindol charakteryzuje się niską toksycznością dla komórek roślinnych, co otwiera dobre perspektywy dla jego przyszłego zastosowania komercyjnego.
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Uniwersytetu Yeungnam w Gyeongsan w Korei, a metody przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komisji Etycznej Uniwersytetu Yeungnam.
Eksperymenty z inkubacją jaj przeprowadzono stosując ustalone procedury43. Aby ocenić wskaźniki wylęgu (HR), 1-dniowe dorosłe nicienie (około 100 samic i 100 samców) przeniesiono na płytki Petriego zawierające grzyb i pozostawiono do wzrostu na 24 godziny. Następnie jaja wyizolowano i potraktowano 5-jodoindolem (0,05 mM i 0,1 mM) lub awermektyną (10 μg/ml) jako zawiesiną w sterylnej wodzie destylowanej. Te zawiesiny (500 μl; około 100 jaj) przeniesiono do dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowych i inkubowano w temperaturze 22 °C. Zliczenia L2 wykonano po 24 godzinach inkubacji, ale uznano je za martwe, jeśli komórki nie poruszały się po stymulacji cienkim drutem platynowym. Eksperyment przeprowadzono w dwóch etapach, każdy z sześcioma powtórzeniami. Dane z obu eksperymentów połączono i przedstawiono. Procent HR oblicza się następująco:
Śmiertelność larw oceniano przy użyciu wcześniej opracowanych procedur. Jaja nicieni zebrano, a zarodki zsynchronizowano poprzez wylęg w sterylnej wodzie destylowanej w celu uzyskania larw stadium L2. Zsynchronizowane larwy (około 500 nicieni) potraktowano 5-jodoindolem (0,05 mM i 0,1 mM) lub awermektyną (10 μg/ml) i hodowano na płytkach Petriego B. cinerea. Po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 22°C nicienie zebrano do sterylnej wody destylowanej i zbadano pod kątem obecności stadiów L2, L3 i L4. Obecność stadiów L3 i L4 wskazywała na transformację larwalną, natomiast obecność stadia L2 wskazywała na brak transformacji. Obrazy uzyskano za pomocą cyfrowego systemu obrazowania komórek iRiS™. Eksperyment przeprowadzono w dwóch etapach, każdy z sześcioma powtórzeniami. Dane z obu eksperymentów połączono i przedstawiono.
Toksyczność 5-jodoindolu i awermektyny dla nasion oceniono za pomocą testów kiełkowania na płytkach agarowych Murashige i Skooga.62 Nasiona B. oleracea i R. raphanistrum moczono najpierw w sterylnej wodzie destylowanej przez jeden dzień, przemywano 1 ml 100% etanolu, sterylizowano 1 ml 50% komercyjnego wybielacza (3% podchlorynu sodu) przez 15 minut i przemywano pięciokrotnie 1 ml sterylnej wody. Wysterylizowane nasiona wyciskano następnie na płytki agarowe do kiełkowania zawierające 0,86 g/l (0,2X) pożywki Murashige i Skooga oraz 0,7% agaru bakteriologicznego z dodatkiem lub bez dodatku 5-jodoindolu lub awermektyny. Płytki inkubowano w temperaturze 22°C, a po 3 dniach inkubacji wykonano zdjęcia. Eksperyment przeprowadzono w dwóch etapach, z których każdy obejmował sześć powtórzeń.
Czas publikacji: 26-02-2025