Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Odkrycie i korzystne wykorzystanie produktów naturalnych może przyczynić się do poprawy jakości życia ludzi. Chemikalia hamujące wzrost roślin są szeroko stosowane jako herbicydy do zwalczania chwastów. Ze względu na konieczność stosowania różnych rodzajów herbicydów, istnieje potrzeba identyfikacji związków o nowych mechanizmach działania. W niniejszym badaniu odkryliśmy nowy związek N-alkoksypirolowy, kumamonamid, ze Streptomyces werraensis MK493-CF1 i ustaliliśmy kompletny proces syntezy. Poprzez testy aktywności biologicznej odkryliśmy, że kwas urs-monoamidowy jest syntetycznym produktem pośrednim urs-monoamidu i potencjalnym…inhibitor wzrostu roślinPonadto opracowaliśmy różne pochodne kwasu urbenonowego, w tym pochodną urbenyloksylową (UDA), która wykazuje wysoką aktywność herbicydową bez negatywnego wpływu na wzrost komórek HeLa. Stwierdziliśmy również, że pochodne kwasu urmotonowego niszczą mikrotubule roślin; ponadto KAND wpływa na filamenty aktynowe i indukuje śmierć komórek; Te wielopłaszczyznowe efekty różnią się od efektów znanych inhibitorów mikrotubul i sugerują nowy mechanizm działania kwasu ursonowego, co stanowi istotną zaletę w rozwoju nowych herbicydów.
Odkrywanie i praktyczne zastosowanie korzystnych produktów naturalnych i ich pochodnych to sposób na poprawę jakości życia człowieka. Metabolity wtórne wytwarzane przez mikroorganizmy, rośliny i owady doprowadziły do znacznego postępu w medycynie i rolnictwie. Wiele antybiotyków i leków przeciwbiałakowych zostało opracowanych na bazie produktów naturalnych. Ponadto, różne rodzaje…pestycydyZ tych naturalnych produktów ekstrahuje się fungicydy i herbicydy do stosowania w rolnictwie. W szczególności herbicydy do zwalczania chwastów stanowią ważne narzędzia do zwiększania plonów we współczesnym rolnictwie, a różne rodzaje związków chemicznych są już wykorzystywane komercyjnie. Za typowe cele działania herbicydów uznaje się kilka procesów komórkowych w roślinach, takich jak fotosynteza, metabolizm aminokwasów, synteza ścian komórkowych, regulacja mitozy, sygnalizacja fitohormonalna czy synteza białek. Związki hamujące funkcję mikrotubul stanowią powszechną klasę herbicydów, które wpływają na wzrost roślin poprzez regulację mitozy2.
Mikrotubule są składnikami cytoszkieletu i są powszechnie konserwowane w komórkach eukariotycznych. Heterodimer tubuliny składa się z α-tubuliny i β-tubuliny, tworzących liniowe protofilamenty mikrotubul, z 13 protofilamentami tworzącymi strukturę cylindryczną. Mikrotubule odgrywają w komórkach roślinnych wiele ról, w tym determinują kształt komórki, jej podział i transport wewnątrzkomórkowy3,4. Komórki roślinne zawierają mikrotubule pod błoną plazmatyczną interfazy, a te tzw. mikrotubule korowe, jak się uważa, kontrolują organizację mikrofibryli celulozy poprzez regulację kompleksów syntazy celulozy4,5. Mikrotubule korowe komórek epidermy korzeniowej, obecne w strefie szybkiego wydłużania wierzchołka korzenia, są zlokalizowane bocznie, a mikrowłókna celulozowe podążają za tymi mikrotubulami i ograniczają kierunek ekspansji komórek, promując w ten sposób anizotropowe wydłużanie komórek. Dlatego funkcja mikrotubul jest ściśle związana z morfologią roślin. Substytucje aminokwasów w genach kodujących tubulinę powodują zniekształcenie macierzy mikrotubul korowych i lewo- lub prawostronny wzrost u Arabidopsis 6,7. Podobnie, mutacje w białkach związanych z mikrotubulami, które regulują ich dynamikę, mogą również prowadzić do zaburzeń wzrostu korzeni8,9,10,11,12,13. Ponadto, leczenie herbicydami niszczącymi mikrotubule, takimi jak dizopiramid, znany również jako pretilachlor, również powoduje lewostronny skośny wzrost korzeni14. Dane te wskazują, że precyzyjna regulacja funkcji mikrotubul ma kluczowe znaczenie dla określenia kierunku wzrostu rośliny.
Odkryto różne rodzaje inhibitorów mikrotubul, które wniosły znaczący wkład w badania cytoszkieletu, a także w rolnictwo i medycynę2. W szczególności oryzalina, związki dinitroaniliny, dyzopiramid, związki pokrewne benzamidowi i ich analogi mogą hamować funkcję mikrotubul, a tym samym hamować wzrost roślin. Dlatego są szeroko stosowane jako herbicydy. Ponieważ jednak mikrotubule są ważnym składnikiem komórek roślinnych i zwierzęcych, większość inhibitorów mikrotubul jest cytotoksyczna dla obu typów komórek. Dlatego, pomimo ich uznanej przydatności jako herbicydów, ograniczona liczba środków antymikrotubulowych jest stosowana w praktyce.
Streptomyces to rodzaj z rodziny Streptomyces, obejmującej tlenowe, Gram-dodatnie bakterie nitkowate, powszechnie znany ze swojej zdolności do wytwarzania szerokiej gamy metabolitów wtórnych. Dlatego jest uważany za jedno z najważniejszych źródeł nowych biologicznie aktywnych produktów naturalnych. W niniejszym badaniu odkryliśmy nowy związek o nazwie kumamonamid, który został wyizolowany z Streptomyces werraensis MK493-CF1 i S. werraensis ISP 5486. Za pomocą analizy widmowej i pełnej analizy widmowej scharakteryzowano strukturę kumamonamidu i określono jego unikalny szkielet N-alkoksypirolowy. Stwierdzono, że kwas ursmonowy, syntetyczny produkt pośredni ursmonoamidu i jego pochodnych, hamuje wzrost i kiełkowanie popularnej rośliny modelowej Arabidopsis thaliana. W badaniu zależności struktura-aktywność odkryliśmy, że związek z C9 zmodyfikowanym do kwasu ursonowego, zwany nonyloksy pochodną kwasu ursonowego (KAND), znacząco wzmacnia hamujący wpływ na wzrost i kiełkowanie. Co istotne, nowo odkryty inhibitor wzrostu roślin wpływał również na wzrost tytoniu i wątrobowca i nie był cytotoksyczny dla bakterii ani komórek HeLa. Co więcej, niektóre pochodne kwasu urmotonowego indukują zniekształcony fenotyp korzeni, co sugeruje, że te pochodne bezpośrednio lub pośrednio wpływają na mikrotubule. Zgodnie z tą teorią, nasze obserwacje mikrotubul znakowanych immunohistochemicznie lub białkami fluorescencyjnymi wskazują, że traktowanie KAND powoduje depolimeryzację mikrotubul. Ponadto, traktowanie pochodnymi kwasu kumamotonowego rozrywało mikrofilamenty aktynowe. W ten sposób odkryliśmy nowy inhibitor wzrostu roślin, którego unikalny mechanizm działania polega na niszczeniu cytoszkieletu.
Szczep MK493-CF1 został wyizolowany z gleby w Shinagawa-ku w Tokio. Szczep MK493-CF1 tworzył dobrze rozgałęzioną grzybnię stromalną. Określono częściową sekwencję genu rybosomalnego RNA 16S (1422 pz). Szczep ten jest bardzo podobny do S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pz, T: szczep typowy, 99,93%). Na podstawie tego wyniku ustalono, że szczep ten jest blisko spokrewniony ze szczepem typowym S. werraensis. Dlatego tymczasowo nazwaliśmy go S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T również wytwarza te same związki bioaktywne. Ponieważ początkowo niewiele było badań nad pozyskiwaniem naturalnych produktów z tego mikroorganizmu, przeprowadzono dalsze badania chemiczne. Po hodowli S. werraensis MK493-CF1 na podłożu jęczmiennym poprzez fermentację w fazie stałej w temperaturze 30°C przez 14 dni, podłoże ekstrahowano 50% etanolem. Próbkę o objętości 60 ml wysuszono, uzyskując 59,5 mg surowego ekstraktu. Surowy ekstrakt poddano chromatografii HPLC z odwróconą fazą, uzyskując N-metoksy-1H-pirolo-2-karboksyamid (1, zwany kumamonamidem, 36,0 mg). Całkowita ilość 1 stanowi około 60% surowego ekstraktu. Dlatego postanowiliśmy szczegółowo zbadać właściwości kumamotoamidu 1.
Kumamonamid 1 to biały, amorficzny proszek, a wysokorozdzielcza spektrometria mas (HRESIMS) potwierdza obecność C6H8N2O2 (rys. 1). Fragment pirolu podstawiony w pozycji C2 tego związku charakteryzuje się wartościami δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH w widmie 1H NMR: 4,5 Hz, H-5) i δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), a widmo 13C NMR wykazuje obecność czterech atomów węgla sp2. Obecność grupy amidowej w pozycji C2 została oceniona na podstawie korelacji HMBC od protonu C-3 do węgla karbonylu amidu przy δC 161,1. Ponadto, piki 1H i 13C NMR przy δH 4,10 (3H, S) i δC 68,3 wskazują na obecność grup N-metoksylowych w cząsteczce. Chociaż prawidłowa pozycja grupy metoksylowej nie została jeszcze ustalona za pomocą analizy spektroskopowej, takiej jak rozszerzona spektroskopia różnicowa i jądrowy skrót Overhausera (NOEDF), N-metoksy-1H-pirolo-2-karboksyamid stał się pierwszym związkiem kandydującym.
Aby określić prawidłową strukturę 1, przeprowadzono syntezę całkowitą (rys. 2a). Działanie komercyjnie dostępnej 2-aminopirydyny 2 na m-CPBA dało odpowiadający jej N-tlenek 3 z wydajnością ilościową. Po 2-aminoazydacji 2, reakcję cyklokondensacji opisaną przez Abramowicza przeprowadzono w benzenie w temperaturze 90°C, otrzymując pożądany 1-hydroksy-1H-pirolo-2-karbonitryl 5 w gramach. Szybkość 60% (dwa etapy). 15,16. Metylacja i hydroliza 4 dała następnie kwas 1-metoksy-1H-pirolo-2-karboksylowy (nazywany „kwasem kumotonowym”, 6) z dobrą wydajnością (70%, dwa etapy). Ostatecznie amidowanie za pomocą chlorku kwasowego, będącego pośrednim związkiem 6, przy użyciu wody amoniakalnej dało amid Kumamoto 1 z wydajnością 98%. Wszystkie dane widmowe syntetyzowanego 1 były podobne do wyizolowanego 1, więc określono strukturę 1;
Ogólna synteza i analiza aktywności biologicznej urbenamidu i kwasu urbenowego. (a) Całkowita synteza amidu Kumamoto. (b) Siedmiodniowe siedmiodniowe siedmioszczepowe siewki Arabidopsis Columbia (Col) typu dzikiego hodowano na płytkach Murashige i Skoog (MS) zawierających kumamonamid 6 lub kumamonamid 1 w podanych stężeniach. Skala = 1 cm.
Najpierw oceniliśmy aktywność biologiczną urbenamidu i jego produktów pośrednich pod kątem ich zdolności do modulowania wzrostu roślin. Dodaliśmy różne stężenia ursmonamidu 1 lub kwasu ursmonowego 6 do podłoża agarowego MS i hodowaliśmy siewki Arabidopsis thaliana na tym podłożu. Testy te wykazały, że wysokie stężenia (500 μM) ursmonamidu 6 hamowały wzrost korzeni (rys. 2b). Następnie wygenerowaliśmy różne pochodne, zastępując pozycję N1 w pozycji 6 i przeprowadziliśmy na nich badania zależności struktura-aktywność (proces syntezy analogów opisano w materiałach dodatkowych (SI)). Siewki Arabidopsis hodowano na podłożu zawierającym 50 μM pochodnych kwasu ursmonowego, a następnie mierzono długość korzeni, jak pokazano na rysunku. Jak pokazano na rysunkach 3a, b i S1, kwasy kumowe mają różną długość liniowych łańcuchów alkoksylowych (9, 10, 11, 12 i 13) lub duże łańcuchy alkoksylowe (15, 16 i 17) w pozycji N1. Pochodne wykazały znaczące hamowanie wzrostu korzeni. Ponadto stwierdziliśmy, że zastosowanie 200 μM 10, 11 lub 17 hamowało kiełkowanie (rys. 3c i S2).
Badanie zależności między strukturą a aktywnością amidu kumamoto i związków pokrewnych. (a) Struktura i schemat syntezy analogów. (b) Kwantyfikacja długości korzeni siewek 7-dniowych hodowanych na podłożu MS z pochodnymi kumamonamidu w stężeniu 50 μM lub bez nich. Gwiazdki oznaczają istotne różnice w przypadku leczenia pozorowanego (test t, p< 0,05). n>18. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. nt oznacza „nie testowano”, ponieważ ponad 50% nasion nie wykiełkowało. (c) Kwantyfikacja szybkości kiełkowania nasion poddanych zabiegowi, inkubowanych przez 7 dni w podłożu MS z dodatkiem lub bez dodatku 200 μM kumamonamidu i związków pokrewnych. Gwiazdki oznaczają istotne różnice w przypadku zabiegu pozorowanego (test chi-kwadrat). n = 96.
Co ciekawe, dodanie łańcuchów bocznych alkilowych dłuższych niż C9 zmniejszyło aktywność hamującą, co sugeruje, że związki pokrewne kwasowi kumamotojowemu wymagają łańcuchów bocznych o określonej długości, aby wykazywać swoją aktywność biologiczną.
Ponieważ analiza zależności struktura-aktywność wykazała, że C9 został zmodyfikowany do kwasu ursonowego, a nonyloksylowa pochodna kwasu ursonowego (dalej zwana KAND 11) była najskuteczniejszym inhibitorem wzrostu roślin, przeprowadziliśmy bardziej szczegółową charakterystykę KAND 11. Traktowanie Arabidopsis 50 μM KAND 11 prawie całkowicie zapobiegło kiełkowaniu, podczas gdy niższe stężenia (40, 30, 20 lub 10 μM) KAND 11 hamowały wzrost korzeni w sposób zależny od dawki (ryc. 4a, b). Aby sprawdzić, czy KAND 11 wpływa na żywotność merystemu korzeniowego, zbadaliśmy merystemy korzeniowe barwione jodkiem propidyny (PI) i zmierzyliśmy wielkość powierzchni merystemu. Wielkość merystemu siewek wyhodowanych na podłożu zawierającym 25 μM KAND-11 wynosiła 151,1 ± 32,5 μm, podczas gdy wielkość merystemu siewek wyhodowanych na podłożu kontrolnym zawierającym DMSO wynosiła 264,7 ± 30,8 μm (rys. 4c, d), co wskazuje, że KAND-11 przywraca aktywność komórkową. rozprzestrzenianie. Merystem korzeniowy. Zgodnie z tym, leczenie KAND 11 zmniejszyło ilość sygnału markera podziału komórek CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS w merystemie korzeniowym (rys. 4e) 17 . Wyniki te wskazują, że KAND 11 hamuje wzrost korzeni poprzez zmniejszenie aktywności proliferacji komórek.
Analiza hamującego wpływu pochodnych kwasu urbenonowego (pochodnych urbenyloksylowych) na wzrost. (a) 7-dniowe siewki Col typu dzikiego hodowane na płytkach MS z podanymi stężeniami KAND 11. Skala = 1 cm. (b) Kwantyfikacja długości korzeni. Litery oznaczają istotne różnice (test Tukeya HSD, p< 0,05). n>16. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. (c) Mikroskopia konfokalna korzeni Col typu dzikiego barwionych jodkiem propidyny, wyhodowanych na płytkach MS z dodatkiem 25 μM KAND 11 lub bez niego. Białe nawiasy oznaczają merystem korzeniowy. Skala = 100 µm. (d) Kwantyfikacja wielkości merystemu korzeniowego (n = 10 do 11). Różnice statystyczne określono za pomocą testu t (p< 0,05). Słupki oznaczają średnią wielkość merystemu. (e) Mikroskopia różnicowo-interferencyjna (DIC) merystemu korzeniowego zawierającego konstrukcję CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS barwioną i barwioną na 5-dniowych siewkach hodowanych na płytkach MS z lub bez testu KAND 25 µM.
Fitotoksyczność KAND 11 przetestowano dodatkowo z wykorzystaniem innej rośliny dwuliściennej, tytoniu (Nicotiana tabacum), oraz ważnego organizmu modelowego roślin lądowych, wątrobowca (Marchantia polymorpha). Podobnie jak w przypadku Arabidopsis, sadzonki tytoniu SR-1 uprawiane na podłożu zawierającym 25 μM KAND 11 wytworzyły krótsze korzenie (ryc. 5a). Ponadto, 40 z 48 nasion wykiełkowało na płytkach zawierających 200 μM KAND 11, podczas gdy wszystkie 48 nasion wykiełkowało na podłożu pozornie zaprawianym, co wskazuje na istotność wyższych stężeń KAND (p< 0,05; test chi - kwadrat) hamował kiełkowanie tytoniu. (Rys. 5b). Ponadto stężenie KAND 11, które hamowało wzrost bakterii w wątrobowcu, było podobne do stężenia efektywnego w Arabidopsis (Rys. 5c). Wyniki te wskazują, że KAND 11 może hamować wzrost różnych roślin. Następnie zbadaliśmy możliwą cytotoksyczność związków pokrewnych monoamidom niedźwiedzim w innych organizmach, mianowicie ludzkich komórkach HeLa i szczepie Escherichia coli DH5α, odpowiednio jako przedstawicielach wyższych komórek zwierzęcych i bakteryjnych. W serii testów proliferacji komórek zaobserwowaliśmy, że kumamonamid 1, kwas kumamonamidowy 6 i KAND 11 nie wpływały na wzrost komórek HeLa ani E. coli przy stężeniach 100 μM (Rys. 5d, e).
Hamowanie wzrostu KAND 11 u organizmów innych niż Arabidopsis. (a) Dwutygodniowe siewki tytoniu SR-1 typu dzikiego hodowano na pionowo ustawionych płytkach MS zawierających 25 μM KAND 11. (b) Dwutygodniowe siewki tytoniu SR-1 typu dzikiego hodowano na poziomo ustawionych płytkach MS zawierających 200 μM KAND 11. (c) Dwutygodniowe pąki wątrobowca Tak-1 typu dzikiego hodowano na płytkach Gamborg B5 z podanymi stężeniami KAND 11. Czerwone strzałki wskazują zarodniki, które przestały rosnąć w ciągu dwutygodniowego okresu inkubacji. (d) Test proliferacji komórek HeLa. Liczbę żywych komórek mierzono w ustalonych odstępach czasu za pomocą zestawu do liczenia komórek 8 (Dojindo). Jako kontrolę komórki HeLa traktowano aktynomycyną D (Act D) w stężeniu 5 μg/ml, która hamuje transkrypcję polimerazy RNA i powoduje śmierć komórek. Analizy przeprowadzono trzykrotnie. (e) Test proliferacji komórek E. coli. Wzrost E. coli analizowano, mierząc OD600. Jako kontrolę komórki traktowano ampicyliną (Amp) w stężeniu 50 μg/ml, która hamuje syntezę ściany komórkowej bakterii. Analizy przeprowadzono trzykrotnie.
Aby rozszyfrować mechanizm działania cytotoksyczności wywołanej przez związki pokrewne uramidowi, ponownie przeanalizowaliśmy pochodne kwasu urbenidowego o umiarkowanym działaniu hamującym, jak pokazano na rysunku. Jak pokazano na rysunkach 2b i 6a, siewki hodowane na płytkach agarowych zawierających wysokie stężenia (200 μM) kwasu urmotonowego 6 wytwarzały krótsze i lewoskrętne korzenie (θ = – 23,7 ± 6,1), podczas gdy siewki hodowane na podłożu kontrolnym wytwarzały prawie proste korzenie (θ = – 3,8 ± 7,1). Wiadomo, że ten charakterystyczny skośny wzrost wynika z dysfunkcji mikrotubul korowych14,18. Zgodnie z tym odkryciem, leki destabilizujące mikrotubule, dizopiramid i oryzalina, indukowały podobne przechylenie korzeni w naszych warunkach wzrostu (rys. 2b i 6a). Jednocześnie testowaliśmy pochodne kwasu urmotonowego i wybraliśmy kilka z nich, które w pewnych stężeniach indukowały skośny wzrost korzeni. Związki 8, 9 i 15 zmieniały kierunek wzrostu korzeni odpowiednio przy stężeniu 75 μM, 50 μM i 40 μM, co wskazuje, że związki te mogą skutecznie destabilizować mikrotubule (rys. 2b, 6a). Testowaliśmy również najsilniejszą pochodną kwasu ursolowego, KAND 11, w niższym stężeniu (15 μM) i stwierdziliśmy, że zastosowanie KAND 11 hamowało wzrost korzeni, a kierunek wzrostu korzeni był nierównomierny, chociaż miały one tendencję do nachylenia w lewo (rysunek C3). Ponieważ wyższe stężenia leków destabilizujących mikrotubule czasami hamują wzrost roślin, a nie powodują przechylenia korzeni, oceniliśmy następnie możliwość, że KAND 11 wpływa na mikrotubule, obserwując mikrotubule korowe w komórkach naskórka korzeni. Immunohistochemia z użyciem przeciwciał anty-β-tubulina w komórkach epidermy korzeni siewek traktowanych 25 μM KAND 11 wykazała zanik prawie wszystkich mikrotubul korowych w komórkach epidermy w strefie elongacji (ryc. 6b). Wyniki te wskazują, że kwas kumamotonowy i jego pochodne działają bezpośrednio lub pośrednio na mikrotubule, rozrywając je, i że związki te są nowymi inhibitorami mikrotubul.
Kwas ursonowy i jego pochodne modyfikują mikrotubule korowe u Arabidopsis thaliana. (a) Kąt nachylenia korzenia mierzony w obecności różnych pochodnych kwasu urmotonowego w podanych stężeniach. Przeanalizowano również działanie dwóch związków hamujących mikrotubule: dizopiramidu i oryzaliny. Wstawka przedstawia standard stosowany do pomiaru kąta wzrostu korzeni. Gwiazdki oznaczają istotne różnice w przypadku leczenia pozorowanego (test t, p< 0,05). n>19. Skala = 1 cm. (b) Mikrotubule korowe w komórkach epidermy w strefie elongacji. Mikrotubule w korzeniach Arabidopsis Col dzikiego typu hodowanych na płytkach MS z 25 μM KAND 11 lub bez niego uwidoczniono za pomocą barwienia immunohistochemicznego z użyciem przeciwciał pierwszorzędowych dla β-tubuliny i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z Alexa Fluor. Skala = 10 µm. (c) Struktura mitotyczna mikrotubul w merystemie korzenia. Mikrotubule uwidoczniono za pomocą barwienia immunohistochemicznego. Struktury mitotyczne, w tym strefy profazy, wrzeciona podziałowe i fragmoplasty, zliczono na podstawie obrazów konfokalnych. Strzałki wskazują struktury mikrotubul mitotycznych. Gwiazdki oznaczają istotne różnice w przypadku leczenia pozorowanego (test t, p< 0,05). n>9. Podziałka = 50 µm.
Chociaż Ursa ma zdolność do zakłócania funkcji mikrotubul, oczekuje się, że jej mechanizm działania będzie inny niż typowych środków depolimeryzujących mikrotubule. Na przykład, wyższe stężenia środków depolimeryzujących mikrotubule, takich jak dizopiramid i oryzalina, indukują anizotropową ekspansję komórek naskórka, podczas gdy KAND 11 tego nie robi. Ponadto, jednoczesne stosowanie KAND 11 i dizopiramidu skutkowało łączną odpowiedzią wzrostu korzeni indukowaną przez dizopiramid, a także zaobserwowano zahamowanie wzrostu indukowane przez KAND 11 (ryc. S4). Przeanalizowaliśmy również odpowiedź nadwrażliwego mutanta dizopiramidu 1-1 (phs1-1) na KAND 11. Phs1-1 ma niekanoniczną mutację punktową kinazy tubuliny i wytwarza krótsze korzenie po leczeniu dizopiramidem9,20. Siewki mutantów phs1-1 wyhodowane na podłożu agarowym zawierającym KAND 11 miały krótsze korzenie, podobnie jak te wyhodowane na dizopiramidzie (ryc. S5).
Ponadto zaobserwowaliśmy struktury mikrotubul mitotycznych, takie jak strefy profazy, wrzeciona i fragmoplasty w merystemie korzeniowym sadzonek traktowanych KAND 11. Zgodnie z obserwacjami dla CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, zaobserwowano znaczący spadek liczby mikrotubul mitotycznych (ryc. 6c).
Aby scharakteryzować cytotoksyczność KAND 11 w rozdzielczości subkomórkowej, poddaliśmy działaniu KAND 11 zawiesinę komórek tytoniu BY-2 i obserwowaliśmy ich odpowiedź. Najpierw dodaliśmy KAND 11 do komórek BY-2 ekspresujących TagRFP-TUA6, który fluorescencyjnie znakuje mikrotubule, aby ocenić wpływ KAND 11 na mikrotubule korowe. Gęstość mikrotubul korowych oceniano za pomocą analizy obrazu, która określała ilościowo odsetek pikseli cytoszkieletu wśród pikseli cytoplazmatycznych. Wyniki testu wykazały, że po leczeniu 50 μM lub 100 μM KAND 11 przez 1 godzinę gęstość zmniejszyła się znacząco do 0,94 ± 0,74% lub 0,23 ± 0,28%, odpowiednio, podczas gdy gęstość komórek poddanych działaniu DMSO wyniosła 1,61 ± 0,34% (rys. 7a). Wyniki te są zgodne z obserwacją u Arabidopsis, że traktowanie KAND 11 indukuje depolimeryzację mikrotubul korowych (ryc. 6b). Zbadaliśmy również linię BY-2 z filamentami aktynowymi znakowanymi GFP-ABD po traktowaniu tym samym stężeniem KAND 11 i zaobserwowaliśmy, że traktowanie KAND 11 rozbiło filamenty aktynowe. Traktowanie 50 μM lub 100 μM KAND 11 przez 1 godzinę znacząco zmniejszyło gęstość filamentów aktynowych do odpowiednio 1,20 ± 0,62% lub 0,61 ± 0,26%, podczas gdy gęstość w komórkach traktowanych DMSO wynosiła 1,69 ± 0,51% (ryc. 2). 7b). Wyniki te kontrastują z efektami propyzamidu, który nie wpływa na filamenty aktynowe, i latrunkuliny B, depolimeryzatora aktyny, który nie wpływa na mikrotubule (SI Rysunek S6). Ponadto, leczenie kumamonamidem 1, kwasem kumamonamidowym 6 lub KAND 11 nie wpłynęło na mikrotubule w komórkach HeLa (rysunek SI S7). Uważa się zatem, że mechanizm działania KAND 11 różni się od mechanizmu działania znanych substancji zaburzających cytoszkielet. Co więcej, nasza obserwacja mikroskopowa komórek BY-2 leczonych KAND 11 ujawniła początek obumierania komórek podczas leczenia KAND 11 i wykazała, że odsetek martwych komórek barwionych błękitem Evansa nie wzrósł istotnie po 30 minutach leczenia KAND 11, natomiast po 90 minutach leczenia 50 μM lub 100 μM KAND liczba martwych komórek wzrosła odpowiednio do 43,7% lub 80,1% (rysunek 7c). Podsumowując, dane te wskazują, że nowa pochodna kwasu ursolowego, KAND 11, jest roślinnym inhibitorem cytoszkieletu o nieznanym dotychczas mechanizmie działania.
KAND wpływa na mikrotubule korowe, filamenty aktynowe i żywotność komórek BY-2 tytoniu. (a) Wizualizacja mikrotubul korowych w komórkach BY-2 w obecności TagRFP-TUA6. Komórki BY-2 poddane działaniu KAND 11 (50 μM lub 100 μM) lub DMSO zbadano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Gęstość mikrotubul korowych obliczono na podstawie mikrofotografii 25 niezależnych komórek. Znamienne różnice oznaczono literami (test Tukeya HSD, p< 0,05). Skala = 10 µm. (b) Filamenty aktynowe kory mózgowej w komórkach BY-2 uwidocznione w obecności GFP-ABD2. Komórki BY-2 poddane działaniu KAND 11 (50 μM lub 100 μM) lub DMSO zbadano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Gęstość filamentów aktynowych kory mózgowej obliczono na podstawie mikrofotografii 25 niezależnych komórek. Znamienne różnice oznaczono literami (test Tukeya HSD, p< 0,05). Skala = 10 µm. (c) Obserwacja martwych komórek BY-2 za pomocą barwienia błękitem Evansa. Komórki BY-2 poddane działaniu KAND 11 (50 µM lub 100 µM) lub DMSO badano pod mikroskopem jasnego pola. n = 3. Skala = 100 µm.
Odkrycie i zastosowanie nowych produktów naturalnych doprowadziło do znaczącego postępu w różnych aspektach życia człowieka, w tym w medycynie i rolnictwie. Prowadzono badania historyczne w celu uzyskania użytecznych związków z zasobów naturalnych. W szczególności wiadomo, że promieniowce są użyteczne jako antybiotyki przeciwpasożytnicze przeciwko nicieniom ze względu na ich zdolność do wytwarzania różnych metabolitów wtórnych, takich jak awermektyna, główny związek iwermektyny i bleomycyny oraz jej pochodnych, stosowanych w medycynie jako środek przeciwnowotworowy21,22. Podobnie, odkryto różnorodne związki chwastobójcze u promieniowców, z których niektóre są już stosowane komercyjnie1,23. Dlatego analiza metabolitów promieniowców w celu wyizolowania produktów naturalnych o pożądanej aktywności biologicznej jest uważana za skuteczną strategię. W niniejszym badaniu odkryliśmy nowy związek, kumamonamid, z S. werraensis i z powodzeniem go zsyntetyzowaliśmy. Kwas ursonowy jest syntetycznym produktem pośrednim urbenamidu i jego pochodnych. Może powodować charakterystyczne zwijanie się korzeni, wykazywać umiarkowane do silnego działanie chwastobójcze i bezpośrednio lub pośrednio uszkadzać mikrotubule roślin. Mechanizm działania kwasu urmotonowego może jednak różnić się od mechanizmu działania istniejących inhibitorów mikrotubul, ponieważ KAND 11 również niszczy filamenty aktynowe i powoduje śmierć komórek, co sugeruje mechanizm regulacyjny, poprzez który kwas urmotonowy i jego pochodne wpływają na szeroki zakres struktur cytoszkieletu.
Dalsza szczegółowa charakterystyka kwasu ursonowego pomoże lepiej zrozumieć mechanizm jego działania. W szczególności, kolejnym celem jest ocena zdolności kwasu ursonowego do wiązania się ze zredukowanymi mikrotubulami, aby ustalić, czy kwas ursonowy i jego pochodne działają bezpośrednio na mikrotubule i depolimeryzują je, czy też ich działanie prowadzi do destabilizacji mikrotubul. Ponadto, w przypadku gdy mikrotubule nie są bezpośrednim celem, identyfikacja miejsca działania i celów molekularnych kwasu ursonowego na komórkach roślinnych pomoże w lepszym zrozumieniu właściwości pokrewnych związków i możliwych sposobów poprawy aktywności herbicydowej. Nasz test bioaktywności wykazał wyjątkową cytotoksyczność kwasu ursonowego dla wzrostu roślin takich jak Arabidopsis thaliana, tytoń i wątrobowiec, podczas gdy nie miało to wpływu na komórki E. coli ani HeLa. Niewielka lub żadna toksyczność dla komórek zwierzęcych jest zaletą pochodnych kwasu ursonowego, jeśli zostaną one opracowane jako herbicydy do stosowania na otwartych polach uprawnych. Rzeczywiście, ponieważ mikrotubule są powszechnymi strukturami u eukariotów, ich selektywne hamowanie w roślinach jest kluczowym wymogiem dla herbicydów. Na przykład propyzamid, czynnik depolimeryzujący mikrotubule, który bezpośrednio wiąże się z tubuliną i hamuje polimeryzację, jest stosowany jako herbicyd ze względu na niską toksyczność dla komórek zwierzęcych24. W przeciwieństwie do dizopiramidu, pokrewne benzamidy charakteryzują się inną specyficznością docelową. Oprócz mikrotubul roślinnych, RH-4032, czyli benzoksamid, hamuje również mikrotubule komórek zwierzęcych lub lęgniowców, a zalilamid jest stosowany jako fungicyd ze względu na niską fitotoksyczność25,26,27. Nowo odkryty miód i jego pochodne wykazują selektywną cytotoksyczność wobec roślin, ale warto zauważyć, że dalsze modyfikacje mogą zmienić ich specyficzność docelową, potencjalnie dostarczając dodatkowych pochodnych do zwalczania grzybów patogennych lub lęgniowców.
Unikalne właściwości kwasu urbenonowego i jego pochodnych są przydatne w rozwoju tych substancji jako herbicydów oraz narzędzi badawczych. Znaczenie cytoszkieletu w kontrolowaniu kształtu komórek roślinnych jest powszechnie znane. Wcześniejsze badania wykazały, że rośliny wykształciły złożone mechanizmy organizacji mikrotubul korowych poprzez kontrolowanie ich dynamiki, co pozwala na prawidłową kontrolę morfogenezy. Zidentyfikowano wiele cząsteczek odpowiedzialnych za regulację aktywności mikrotubul, a badania w tym zakresie wciąż trwają3,4,28. Nasza obecna wiedza na temat dynamiki mikrotubul w komórkach roślinnych nie wyjaśnia w pełni mechanizmów organizacji mikrotubul korowych. Na przykład, chociaż zarówno dizopiramid, jak i oryzalina mogą depolimeryzować mikrotubule, dizopiramid powoduje poważne zniekształcenie korzeni, podczas gdy oryzalina ma stosunkowo łagodny wpływ. Co więcej, mutacje w tubulinie, która stabilizuje mikrotubule, powodują również prawoskrętność korzeni, podczas gdy paklitaksel, który również stabilizuje dynamikę mikrotubul, nie powoduje takiego efektu. Dlatego badanie i identyfikacja molekularnych celów kwasu ursolowego powinny dostarczyć nowych informacji na temat regulacji mikrotubul kory roślinnej. Podobnie, przyszłe porównania substancji chemicznych skutecznie promujących zaburzenia wzrostu, takich jak dyzopiramid, z mniej skutecznymi substancjami chemicznymi, takimi jak oryzalina czy kwas kumamotoryczny, dostarczą wskazówek dotyczących przyczyn zaburzeń wzrostu.
Z drugiej strony, rearanżacje cytoszkieletu związane z obroną stanowią kolejną możliwość wyjaśnienia cytotoksyczności kwasu ursonowego. Zakażenie patogenem lub wprowadzenie elicytora do komórek roślinnych czasami powoduje zniszczenie cytoszkieletu i późniejszą śmierć komórki29. Na przykład, doniesiono, że kryptoksantyna pochodząca z lęgniowców niszczy mikrotubule i filamenty aktynowe przed śmiercią komórek tytoniu, podobnie jak dzieje się to w przypadku leczenia KAND30,31. Podobieństwa między odpowiedziami obronnymi a odpowiedziami komórkowymi indukowanymi przez kwas ursonowy doprowadziły nas do hipotezy, że wyzwalają one wspólne procesy komórkowe, chociaż widoczne jest szybsze i silniejsze działanie kwasu ursonowego niż kryptoksantyny. Jednakże badania wykazały, że rozerwanie filamentów aktynowych sprzyja spontanicznej śmierci komórek, której nie zawsze towarzyszy rozerwanie mikrotubul29. Ponadto, pozostaje niejasne, czy patogen, czy elicytor powoduje zaburzenia wzrostu korzeni, tak jak dzieje się to w przypadku pochodnych kwasu ursonowego. Zatem wiedza molekularna łącząca reakcje obronne z cytoszkieletem stanowi atrakcyjny problem do rozwiązania. Wykorzystanie obecności związków o niskiej masie cząsteczkowej pokrewnych kwasowi ursonowemu, a także szeregu pochodnych o różnym potencjale działania, może umożliwić ukierunkowanie działania na nieznane mechanizmy komórkowe.
Podsumowując, odkrycie i zastosowanie nowych związków modulujących dynamikę mikrotubul zapewni skuteczne metody badania złożonych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kształtowania komórek roślinnych. W tym kontekście, niedawno opracowany związek, kwas urmotonowy, który wpływa na mikrotubule i filamenty aktynowe oraz indukuje śmierć komórek, może stanowić okazję do rozszyfrowania związku między kontrolą mikrotubul a tymi innymi mechanizmami. Zatem analiza chemiczna i biologiczna z wykorzystaniem kwasu urbenonowego pomoże nam zrozumieć molekularne mechanizmy regulacyjne kontrolujące cytoszkielet roślin.
Zaszczepić S. werraensis MK493-CF1 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml z przegrodami, zawierającej 110 ml podłoża posiewowego, składającego się z 2% (w/v) galaktozy, 2% (w/v) pasty Essence, 1% (w/v) kompozycji Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ekstraktu kukurydzianego (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonia), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 i 0,2% CaCO3 w wodzie dejonizowanej. (pH 7,4 przed sterylizacją). Hodowle posiewowe inkubowano na wytrząsarce obrotowej (180 obr./min) w temperaturze 27°C przez 2 dni. Hodowla produkcyjna odbywa się poprzez fermentację w stanie stałym. Hodowlę zaszczepiającą (7 ml) przeniesiono do kolby K-1 o pojemności 500 ml zawierającej 40 g pożywki produkcyjnej składającej się z 15 g prasowanego jęczmienia (MUSO Co., Ltd., Japonia) i 25 g dejonizowanej wody (pH nie dostosowane przed sterylizacją). Fermentację prowadzono w temperaturze 30°C w ciemności przez 14 dni. Materiał fermentacyjny ekstrahowano 40 ml/butelkę EtOH i wirowano (1500 g, 4°C, 10 min). Supernatant hodowli (60 ml) ekstrahowano mieszaniną 10% MeOH/EtOAc. Warstwę organiczną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując pozostałość (59,5 mg), którą poddano chromatografii HPLC z elucją gradientową (0–10 minut: 90%) na kolumnie z odwróconą fazą (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, średnica wewnętrzna 10 mm × długość 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minut: 90% H2O/CH3CN do 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minut: 90% H2O/EtOH, 45–155 minut: 90% H2O/EtOH do 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) przy szybkości przepływu 1,5 ml/min, kumamonamid (1, 36,0 mg) wyizolowano w postaci białego amorficznego proszku.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ wartość obliczona: 141,0659, wartość zmierzona: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Nasiona odmiany Columbia (Col-0) uzyskano z Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) za zgodą do celów badawczych. Nasiona Col-0 rozmnożono i utrzymywano w warunkach laboratoryjnych, wykorzystując je jako rośliny Arabidopsis typu dzikiego. Nasiona Arabidopsis wysterylizowano powierzchniowo i hodowano w podłożu Murashige i Skoog o połowie mocy, zawierającym 2% sacharozy (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) kwasu 2-(4-morfolino)etanosulfonowego (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) i 1,5% agaru (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, w temperaturze 23°C i przy stałym oświetleniu. Nasiona mutanta phs1-1 dostarczył T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Nasiona szczepu SR-1 zostały dostarczone przez T. Hashimoto (Instytut Nauki i Technologii w Narze) i wykorzystane jako dziki typ roślin tytoniu. Nasiona tytoniu wysterylizowano powierzchniowo i moczono w sterylnej wodzie przez trzy noce, aby wspomóc kiełkowanie, a następnie umieszczono w roztworze o połowie stężenia zawierającym 2% sacharozy, 0,05% (w/v) MES i 0,8% gumy gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) (pożywka Murashige i Skoog) o pH 5,7 i inkubowano w temperaturze 23°C przy stałym oświetleniu.
Szczep Tak-1 został dostarczony przez T. Kohchi (Uniwersytet w Kioto) i posłużył jako standardowa jednostka eksperymentalna do badania wątrobowca. Gemma została uzyskana z wysterylizowanych roślin hodowlanych, a następnie posiana na podłożu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) zawierającym 1% sacharozy i 0,3% gumy gellan i inkubowana w temperaturze 23°C w świetle ciągłym.
Komórki BY-2 tytoniu (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) zostały dostarczone przez S. Hasezawę (Uniwersytet Tokijski). Komórki BY-2 rozcieńczono 95-krotnie w zmodyfikowanej pożywce Linsmeiera i Skooga i uzupełniano co tydzień kwasem 2,4-dichlorofenoksyoctowym32. Zawiesinę komórek mieszano na wytrząsarce obrotowej przy 130 obr./min w temperaturze 27°C w ciemności. Komórki przemyto 10-krotnie większą objętością świeżej pożywki i zawieszono w tej samej pożywce. Linie komórek transgenicznych BY-2 stabilnie wyrażające marker mikrotubul TagRFP-TUA6 lub marker filamentów aktynowych GFP-ABD2 pod promotorem wirusa mozaiki kalafiora 35S wygenerowano zgodnie z opisem33,34,35. Te linie komórkowe można utrzymywać i synchronizować, stosując procedury podobne do tych zastosowanych w przypadku oryginalnej linii komórkowej BY-2.
Komórki HeLa hodowano w zmodyfikowanym podłożu Eagle'a Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) uzupełnionym o 10% surowicy płodowej bydlęcej, 1,2 U/ml penicyliny i 1,2 μg/ml streptomycyny w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.
Wszystkie eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z japońskimi przepisami i wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
Związki rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) jako roztwory macierzyste i rozcieńczono w podłożu MS w przypadku Arabidopsis i tytoniu lub podłożu Gamborg B5 w przypadku wątrobowca. W celu przeprowadzenia testu zahamowania wzrostu korzeni, na podłożu agarowym zawierającym wskazane związki lub DMSO wysiano ponad 10 nasion na płytkę. Nasiona inkubowano w komorze wzrostowej przez 7 dni. Siewki sfotografowano i zmierzono długość korzeni. W celu przeprowadzenia testu kiełkowania Arabidopsis, na podłożu agarowym zawierającym 200 μM związku lub DMSO wysiano 48 nasion na płytkę. Nasiona Arabidopsis hodowano w komorze wzrostowej, a liczbę wykiełkowanych siewek liczono 7 dni po kiełkowaniu (dag). W celu przeprowadzenia testu kiełkowania tytoniu, na podłożu agarowym zawierającym 200 μM KAND lub DMSO wysiano 24 nasiona na płytkę. Nasiona tytoniu hodowano w komorze wzrostowej, a liczbę kiełkujących siewek liczono po 14 dniach. W celu przeprowadzenia testu zahamowania wzrostu wątrobowca, 9 zarodków z każdej płytki wysiano na podłoże agarowe zawierające wskazane stężenia KAND lub DMSO i inkubowano w komorze wzrostowej przez 14 dni.
Do wizualizacji organizacji merystemu korzeniowego wykorzystano sadzonki barwione jodkiem propidyny (PI) w stężeniu 5 mg/ml. Sygnały PI obserwowano metodą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego TCS SPE (Leica Microsystems).
Barwienie histochemiczne korzeni β-glukuronidazą (GUS) przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym przez Malami i Benfey36. Siewki utrwalano w 90% acetonie przez noc, barwiono 0,5 mg/ml kwasu 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-d-glukuronowego w buforze GUS przez 1 godzinę i umieszczono w uwodnionym roztworze chloroaldehydu (8 g hydratu chloralu, 2 ml wody i 1 ml glicerolu) i obserwowano pod mikroskopem różnicowo-interferencyjnym z użyciem mikroskopu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Kąty korzeni mierzono u 7-dniowych sadzonek uprawianych na pionowych płytkach. Zmierz kąt korzenia względem kierunku wektora grawitacji, jak opisano w kroku 6.
Układ mikrotubul korowych obserwowano zgodnie z opisem, z niewielkimi modyfikacjami protokołu37. Przeciwciało anty-β-tubulinowe (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) oraz sprzężone z Alexa Fluor 488 przeciwciało antymysie IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) użyto jako przeciwciała pierwotne i wtórne w rozcieńczeniach odpowiednio 1:1000 i 1:100. Obrazy fluorescencyjne uzyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego TCS SPE (Leica Microsystems). Wykonano obrazy w układzie Z i utworzono projekcje o maksymalnej intensywności zgodnie z instrukcjami producenta.
Badanie proliferacji komórek HeLa przeprowadzono przy użyciu zestawu Cell Counting Kit 8 (Dojindo) zgodnie z instrukcją producenta.
Wzrost bakterii E. coli DH5α analizowano poprzez pomiar gęstości komórek w hodowli przy użyciu spektrofotometru przy 600 nm (OD600).
Organizację cytoszkieletu w transgenicznych komórkach BY-2 obserwowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w konfokalne urządzenie skanujące CSU-X1 (Yokogawa) i kamerę sCMOS (Zyla, Andor Technology). Gęstość cytoszkieletu oceniano za pomocą analizy obrazu, która określała odsetek pikseli cytoszkieletu wśród pikseli cytoplazmy na obrazach konfokalnych za pomocą oprogramowania ImageJ, jak opisano38,39.
Aby wykryć śmierć komórek w komórkach BY-2, alikwot zawiesiny komórek inkubowano z 0,05% błękitem Evansa przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Selektywne barwienie martwych komórek błękitem Evansa zależy od wypływu barwnika z żywych komórek przez nienaruszoną błonę komórkową40. Zabarwione komórki obserwowano pod mikroskopem jasnego pola (BX53, Olympus).
Komórki HeLa hodowano w DMEM z dodatkiem 10% FBS w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2. Komórki traktowano 100 μM KAND 11, kwasem kumamonowym 6, kumamonamidem 1, 100 ng/ml colcemidu (Gibco) lub 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) przez 6 godzin w temperaturze 37°C. Komórki utrwalano MetOH przez 10 minut, a następnie octanem przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Utrwalone komórki inkubowano z przeciwciałem pierwotnym przeciwko β-tubulinie (1D4A4, Proteintech: 66240-1) rozcieńczonym w 0,5% BSA/PBS przez 2 godziny, przemywano 3-krotnie TBST, a następnie inkubowano z przeciwciałem kozim Alexa Fluor. 488 przez 1 godzinę. – Mysia IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) i 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczonego w 0,5% BSA/PBS. Po trzykrotnym przemyciu TBST, barwione komórki obserwowano pod mikroskopem odwróconym Nikon Eclipse Ti-E. Obrazy rejestrowano chłodzoną kamerą CCD Hamamatsu ORCA-R2 z wykorzystaniem oprogramowania MetaMorph (Molecular Devices).
Czas publikacji: 17-06-2024