Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić stałe wsparcie, wyświetlamy witrynę bez stylów ani JavaScript.
Odkrycie i korzystne wykorzystanie produktów naturalnych może pomóc w poprawie jakości życia człowieka. Substancje chemiczne hamujące wzrost roślin są szeroko stosowane jako herbicydy do zwalczania chwastów. Ze względu na konieczność stosowania różnych rodzajów herbicydów istnieje potrzeba identyfikacji związków o nowych mechanizmach działania. W tym badaniu odkryliśmy nowy związek N-alkoksypirolu, kumamonamid, ze Streptomyces werraensis MK493-CF1 i ustaliliśmy kompletny proces syntezy. Poprzez testy aktywności biologicznej odkryliśmy, że kwas urs-monoamidowy jest syntetycznym produktem pośrednim urs-monoamidu i potencjalnyminhibitor wzrostu roślin. Ponadto opracowaliśmy różne pochodne kwasu urbenonowego, w tym pochodną urbenyloksylową (UDA), która ma wysoką aktywność herbicydową bez negatywnego wpływu na wzrost komórek HeLa. Odkryliśmy również, że pochodne kwasu urmotonowego zakłócają mikrotubule roślin; ponadto KAND wpływa na filamenty aktynowe i indukuje śmierć komórek; Te wieloaspektowe efekty różnią się od efektów znanych inhibitorów mikrotubul i sugerują nowy mechanizm działania kwasu ursonowego, co stanowi ważną zaletę w opracowywaniu nowych herbicydów.
Odkrycie i praktyczne zastosowanie korzystnych produktów naturalnych i ich pochodnych jest sposobem na poprawę jakości życia człowieka. Metabolity wtórne wytwarzane przez mikroorganizmy, rośliny i owady doprowadziły do dużych postępów w medycynie i rolnictwie. Wiele antybiotyków i leków przeciwbiałakowych opracowano z produktów naturalnych. Ponadto różne rodzajepestycydy, fungicydy i herbicydy są ekstrahowane z tych naturalnych produktów do stosowania w rolnictwie. W szczególności herbicydy zwalczające chwasty są ważnymi narzędziami zwiększającymi plony w nowoczesnym rolnictwie, a różne rodzaje związków są już stosowane komercyjnie. Kilka procesów komórkowych w roślinach, takich jak fotosynteza, metabolizm aminokwasów, synteza ścian komórkowych, regulacja mitozy, sygnalizacja fitohormonów lub synteza białek, jest uważanych za typowe cele herbicydów. Związki, które hamują funkcję mikrotubul, są powszechną klasą herbicydów, które wpływają na wzrost roślin poprzez wpływ na regulację mitozy2.
Mikrotubule są składnikami cytoszkieletu i są szeroko konserwowane w komórkach eukariotycznych. Heterodimer tubuliny składa się z α-tubuliny i β-tubuliny tworzących liniowe protofilamenty mikrotubul, przy czym 13 protofilamentów tworzy strukturę cylindryczną. Mikrotubule odgrywają wiele ról w komórkach roślinnych, w tym określają kształt komórki, podział komórek i transport wewnątrzkomórkowy3,4. Komórki roślinne zawierają mikrotubule pod błoną plazmatyczną interfazy, a te tak zwane mikrotubule korowe uważa się za kontrolujące organizację mikrofibryli celulozy poprzez regulację kompleksów syntazy celulozy4,5. Mikrotubule korowe komórek naskórka korzenia, obecne w strefie szybkiego wydłużania wierzchołka korzenia, są zlokalizowane bocznie, a mikrowłókna celulozowe podążają za tymi mikrotubulami i ograniczają kierunek ekspansji komórek, promując w ten sposób anizotropowe wydłużanie komórek. Dlatego funkcja mikrotubul jest ściśle związana z morfologią rośliny. Podstawienia aminokwasów w genach kodujących tubulinę powodują przekrzywienie układów mikrotubul korowych i lewostronny lub prawostronny wzrost u Arabidopsis 6,7. Podobnie mutacje w białkach związanych z mikrotubulami, które regulują dynamikę mikrotubul, mogą również prowadzić do zniekształconego wzrostu korzeni8,9,10,11,12,13. Ponadto leczenie herbicydami zakłócającymi mikrotubule, takimi jak dyzopiramid, znany również jako pretilachlor, również powoduje lewostronny skośny wzrost korzeni14. Dane te wskazują, że precyzyjna regulacja funkcji mikrotubul ma kluczowe znaczenie dla określenia kierunku wzrostu rośliny.
Odkryto różne rodzaje inhibitorów mikrotubul, a leki te wniosły znaczący wkład w badania cytoszkieletu, a także w rolnictwo i medycynę2. W szczególności oryzalina, związki dinitroaniliny, disopyramid, związki pokrewne benzamidowi i ich analogi mogą hamować funkcję mikrotubul, a tym samym hamować wzrost roślin. Dlatego są szeroko stosowane jako herbicydy. Jednak ponieważ mikrotubule są ważnym składnikiem komórek roślinnych i zwierzęcych, większość inhibitorów mikrotubul jest cytotoksyczna dla obu typów komórek. Dlatego też, pomimo ich uznanej przydatności jako herbicydów, ograniczona liczba środków przeciwmikrotubulowych jest stosowana w celach praktycznych.
Streptomyces to rodzaj rodziny Streptomyces, która obejmuje tlenowe, Gram-dodatnie, nitkowate bakterie i jest szeroko znana ze swojej zdolności do wytwarzania szerokiej gamy metabolitów wtórnych. Dlatego jest uważana za jedno z najważniejszych źródeł nowych biologicznie aktywnych produktów naturalnych. W bieżącym badaniu odkryliśmy nowy związek o nazwie kumamonamid, który został wyizolowany ze Streptomyces werraensis MK493-CF1 i S. werraensis ISP 5486. Za pomocą analizy widmowej i pełnej analizy widmowej scharakteryzowano strukturę kumamonamidu i określono jego unikalny szkielet N-alkoksypirolu. synteza. Stwierdzono, że kwas ursmonowy, syntetyczny produkt pośredni ursmonoamidu i jego pochodnych, hamuje wzrost i kiełkowanie popularnej rośliny modelowej Arabidopsis thaliana. W badaniu zależności struktura-aktywność odkryliśmy, że związek z C9 zmodyfikowanym do kwasu ursonowego, zwany pochodną nonyloksy kwasu ursonowego (KAND), znacząco wzmacnia hamujący wpływ na wzrost i kiełkowanie. Co ciekawe, nowo odkryty inhibitor wzrostu roślin wpłynął również na wzrost tytoniu i wątrobowca i nie był cytotoksyczny dla bakterii ani komórek HeLa. Co więcej, niektóre pochodne kwasu urmotonowego indukują zniekształcony fenotyp korzeni, co oznacza, że te pochodne bezpośrednio lub pośrednio wpływają na mikrotubule. Zgodnie z tą ideą, nasze obserwacje mikrotubul znakowanych immunohistochemicznie lub białkami fluorescencyjnymi wskazują, że leczenie KAND depolimeryzuje mikrotubule. Ponadto leczenie pochodnymi kwasu kumamotonowego zaburzyło mikrofilamenty aktynowe. W ten sposób odkryliśmy nowy inhibitor wzrostu roślin, którego unikalny mechanizm działania obejmuje niszczenie cytoszkieletu.
Szczep MK493-CF1 został wyizolowany z gleby w Shinagawa-ku, Tokio. Szczep MK493-CF1 tworzył dobrze rozgałęzioną grzybnię stromalną. Określono częściową sekwencję genu 16S rybosomalnego RNA (1422 pb). Ten szczep jest bardzo podobny do S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: typowy szczep, 99,93%). Na podstawie tego wyniku ustalono, że ten szczep jest blisko spokrewniony ze szczepem typowym S. werraensis. Dlatego tymczasowo nazwaliśmy ten szczep S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T również wytwarza te same związki bioaktywne. Ponieważ wczesne badania nad uzyskiwaniem naturalnych produktów z tego mikroorganizmu były nieliczne, przeprowadzono dalsze badania chemiczne. Po wyhodowaniu S. werraensis MK493-CF1 na podłożu jęczmiennym poprzez fermentację w stanie stałym w temperaturze 30°C przez 14 dni, podłoże ekstrahowano 50% EtOH. 60 ml próbki wysuszono, aby uzyskać 59,5 mg surowego ekstraktu. Surowy ekstrakt poddano odwróconej fazie HPLC, aby uzyskać N-metoksy-1H-pirolo-2-karboksamid (1, nazwany kumamonamidem, 36,0 mg). Całkowita ilość 1 stanowi około 60% surowego ekstraktu. Dlatego postanowiliśmy szczegółowo zbadać właściwości kumamotoamidu 1.
Kumamonamid 1 jest białym amorficznym proszkiem, a spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości (HRESIMS) potwierdza C6H8N2O2 (rys. 1). Podstawiony C2 fragment pirolu tego związku charakteryzuje się δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH w widmie 1H NMR: 4,5 Hz, H-5) i δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), a widmo 13C NMR wykazuje obecność czterech atomów węgla sp2. Obecność grupy amidowej w pozycji C2 oceniono na podstawie korelacji HMBC od protonu C-3 do węgla karbonylu amidu przy δC 161,1. Ponadto piki 1 H i 13 C NMR przy δH 4,10 (3H, S) i δC 68,3 wskazują na obecność grup N-metoksylowych w cząsteczce. Chociaż prawidłowa pozycja grupy metoksylowej nie została jeszcze ustalona za pomocą analizy spektroskopowej, takiej jak rozszerzona spektroskopia różnicowa i skrót jądrowego Overhausera (NOEDF), N-metoksy-1H-pirolo-2-karboksyamid stał się pierwszym związkiem kandydackim.
Aby ustalić prawidłową strukturę 1, przeprowadzono całkowitą syntezę (rys. 2a). Obróbka dostępnej w handlu 2-aminopirydyny 2 m-CPBA skutkowała otrzymaniem odpowiadającego jej N-tlenku 3 z wydajnością ilościową. Po 2-aminoazydacji 2, reakcję cyklokondensacji opisaną przez Abramowicza przeprowadzono w benzenie w temperaturze 90°C, aby uzyskać pożądany 1-hydroksy-1H-pirolo-2-karbonitryl 5 w gramach. Prędkość 60% (dwa etapy). 15,16. Następnie metylowanie i hydroliza 4 dały kwas 1-metoksy-1H-pirolo-2-karboksylowy (określany jako „kwas kumotonowy”, 6) z dobrą wydajnością (70%, dwa etapy). Na koniec amidowanie za pomocą pośredniego chlorku kwasowego 6 przy użyciu amoniaku wodnego dało amid Kumamoto 1 z wydajnością 98%. Wszystkie dane widmowe zsyntetyzowanego 1 były podobne do wyizolowanego 1, więc ustalono strukturę 1;
Ogólna synteza i analiza aktywności biologicznej urbenamidu i kwasu urbenowego. (a) Całkowita synteza amidu Kumamoto. (b) Siedmiodniowe siewki dzikiego typu Arabidopsis Columbia (Col) hodowano na płytkach Murashige i Skoog (MS) zawierających kumamonamid 6 lub kumamonamid 1 w podanych stężeniach. Skala = 1 cm.
Najpierw oceniliśmy aktywność biologiczną urbenamidu i jego produktów pośrednich pod kątem ich zdolności do modulowania wzrostu roślin. Dodaliśmy różne stężenia ursmonamidu 1 lub kwasu ursmonowego 6 do podłoża agarowego MS i hodowaliśmy siewki Arabidopsis thaliana na tym podłożu. Te testy wykazały, że wysokie stężenia (500 μM) 6 hamowały wzrost korzeni (rys. 2b). Następnie wygenerowaliśmy różne pochodne, zastępując pozycję N1 6 i przeprowadziliśmy na nich badania zależności struktura–aktywność (proces syntezy analogowej opisano w Informacjach uzupełniających (SI)). Siewki Arabidopsis hodowano na podłożu zawierającym 50 μM pochodnych kwasu ursonowego, a długość korzeni mierzono, jak pokazano na rysunku. Jak pokazano na rysunkach 3a, b i S1, kwasy kummamo mają różne długości liniowych łańcuchów alkoksylowych (9, 10, 11, 12 i 13) lub duże łańcuchy alkoksylowe (15, 16 i 17) w pozycji N1. Pochodne wykazały znaczące hamowanie wzrostu korzeni. Ponadto stwierdziliśmy, że zastosowanie 200 μM 10, 11 lub 17 hamowało kiełkowanie (rys. 3c i S2).
Badanie zależności struktura-aktywność amidu Kumamoto i pokrewnych związków. (a) Struktura i schemat syntezy analogów. (b) Kwantyfikacja długości korzeni 7-dniowych siewek hodowanych na podłożu MS z 50 μM pochodnych kumamonamidu lub bez nich. Gwiazdki oznaczają istotne różnice w przypadku pozorowanego leczenia (test t, p< 0,05).18. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. nt oznacza „nie testowano”, ponieważ ponad 50% nasion nie wykiełkowało. (c) Kwantyfikacja szybkości kiełkowania nasion poddanych zabiegowi, inkubowanych przez 7 dni w podłożu MS z dodatkiem lub bez dodatku 200 μM kumamonamidu i pokrewnych związków. Gwiazdki oznaczają istotne różnice w przypadku zabiegu pozorowanego (test chi-kwadrat). n=96.
Co ciekawe, dodanie łańcuchów bocznych alkilowych dłuższych niż C9 zmniejszyło aktywność hamującą, co sugeruje, że związki pokrewne kwasowi kumamotojemu wymagają łańcuchów bocznych o określonej długości, aby wykazać swoją aktywność biologiczną.
Ponieważ analiza zależności struktura-aktywność wykazała, że C9 został zmodyfikowany do kwasu ursonowego, a pochodna nonyloksy kwasu ursonowego (zwana dalej KAND 11) była najskuteczniejszym inhibitorem wzrostu roślin, przeprowadziliśmy bardziej szczegółową charakterystykę KAND 11. Traktowanie Arabidopsis 50 μM KAND 11 prawie całkowicie zapobiegło kiełkowaniu, podczas gdy niższe stężenia (40, 30, 20 lub 10 μM) KAND 11 hamowały wzrost korzeni w sposób zależny od dawki (ryc. 4a, b). Aby sprawdzić, czy KAND 11 wpływa na żywotność merystemu korzeniowego, zbadaliśmy merystemy korzeniowe barwione jodkiem propidyny (PI) i zmierzyliśmy wielkość powierzchni merystemu. Wielkość merystemu sadzonek wyhodowanych na podłożu zawierającym 25 μM KAND-11 wynosiła 151,1 ± 32,5 μm, podczas gdy wielkość merystemu sadzonek wyhodowanych na podłożu kontrolnym zawierającym DMSO wynosiła 264,7 ± 30,8 μm (rys. 4c, d), co wskazuje, że KAND-11 przywraca aktywność komórkową. rozprzestrzenianie się. Merystem korzeniowy. Zgodnie z tym, leczenie KAND 11 zmniejszyło ilość markera podziału komórkowego CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sygnału w merystemie korzeniowym (rys. 4e) 17 . Wyniki te wskazują, że KAND 11 hamuje wzrost korzeni poprzez zmniejszenie aktywności proliferacji komórek.
Analiza hamującego wpływu pochodnych kwasu urbenonowego (pochodnych urbenyloksylowych) na wzrost. (a) 7-dniowe siewki Col dzikiego typu hodowane na płytkach MS ze wskazanymi stężeniami KAND 11. Skala = 1 cm. (b) Kwantyfikacja długości korzeni. Litery oznaczają istotne różnice (test Tukey HSD, p< 0,05).16. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. (c) Mikroskopia konfokalna korzeni Col typu dzikiego barwionych jodkiem propidyny, wyhodowanych na płytkach MS z 25 μM KAND lub bez niego. 11. Białe nawiasy oznaczają merystem korzeniowy. Skala = 100 µm. (d) Kwantyfikacja wielkości merystemu korzeniowego (n = 10 do 11). Różnice statystyczne określono przy użyciu testu t (p< 0,05). Słupki oznaczają średni rozmiar merystemu. (e) Mikroskopia różnicowo-interferencyjna (DIC) merystemu korzeniowego zawierającego konstrukcję CDKB2; 1pro: CDKB2; barwione 1-GUS i barwione na 5-dniowych siewkach hodowanych na płytkach MS z lub bez testu KAND 25 µM.
Fitotoksyczność KAND 11 została dodatkowo przetestowana przy użyciu innej rośliny dwuliściennej, tytoniu (Nicotiana tabacum) i głównego organizmu modelowego roślin lądowych, wątrobowca (Marchantia polymorpha). Podobnie jak w przypadku Arabidopsis, sadzonki tytoniu SR-1 uprawiane na podłożu zawierającym 25 μM KAND 11 wytworzyły krótsze korzenie (rys. 5a). Ponadto 40 z 48 nasion wykiełkowało na płytkach zawierających 200 μM KAND 11, podczas gdy wszystkie 48 nasion wykiełkowało na podłożu pozorowanym, co wskazuje, że wyższe stężenia KAND były istotne (p< 0,05; test chi - kwadrat) hamował kiełkowanie tytoniu. (Rys. 5b). Ponadto stężenie KAND 11, które hamowało wzrost bakterii w wątrobowcu, było podobne do stężenia efektywnego w Arabidopsis (Rys. 5c). Wyniki te wskazują, że KAND 11 może hamować wzrost różnych roślin. Następnie zbadaliśmy możliwą cytotoksyczność związków związanych z monoamidem niedźwiedzim w innych organizmach, mianowicie ludzkich komórkach HeLa i szczepie Escherichia coli DH5α, jako przedstawicielach wyższych komórek zwierzęcych i bakteryjnych. W serii testów proliferacji komórek zaobserwowaliśmy, że kumamonamid 1, kwas kumamonamidowy 6 i KAND 11 nie wpływały na wzrost komórek HeLa lub E. coli przy stężeniach 100 μM (Rys. 5d, e).
Hamowanie wzrostu KAND 11 w organizmach innych niż Arabidopsis. (a) Dwutygodniowe sadzonki tytoniu SR-1 dzikiego typu hodowano na pionowo ustawionych płytkach MS zawierających 25 μM KAND 11. (b) Dwutygodniowe sadzonki tytoniu SR-1 dzikiego typu hodowano na poziomo ustawionych płytkach MS zawierających 200 μM KAND 11. (c) Dwutygodniowe pąki wątrobowca Tak-1 dzikiego typu hodowano na płytkach Gamborg B5 ze wskazanymi stężeniami KAND 11. Czerwone strzałki wskazują zarodniki, które przestały rosnąć w ciągu dwutygodniowego okresu inkubacji. (d) Badanie proliferacji komórek HeLa. Liczbę żywych komórek mierzono w ustalonych odstępach czasu przy użyciu zestawu do liczenia komórek 8 (Dojindo). Jako kontrolę komórki HeLa traktowano 5 μg/ml aktynomycyny D (Act D), która hamuje transkrypcję polimerazy RNA i powoduje śmierć komórki. Analizy przeprowadzono trzykrotnie. (e) Badanie proliferacji komórek E. coli. Wzrost E. coli analizowano, mierząc OD600. Jako kontrolę komórki traktowano 50 μg/ml ampicyliny (Amp), która hamuje syntezę ściany komórkowej bakterii. Analizy przeprowadzono trzykrotnie.
Aby rozszyfrować mechanizm działania cytotoksyczności wywołanej przez związki pokrewne uramidowi, ponownie przeanalizowaliśmy pochodne kwasu urbeniowego o umiarkowanym działaniu hamującym, jak pokazano na rysunku. Jak pokazano na rysunkach 2b, 6a, siewki wyhodowane na płytkach agarowych zawierających wysokie stężenia (200 μM) kwasu urmotonowego 6 wytworzyły krótsze i lewoskrętne korzenie (θ = – 23,7 ± 6,1), podczas gdy siewki wyhodowane na podłożu kontrolnym wytworzyły prawie proste korzenie (θ = – 3,8 ± 7,1). Wiadomo, że ten charakterystyczny skośny wzrost jest wynikiem dysfunkcji mikrotubul korowych14,18. Zgodnie z tym odkryciem leki destabilizujące mikrotubule, disopiramid i oryzalin, wywołały podobne przechylenie korzeni w naszych warunkach wzrostu (rys. 2b, 6a). Jednocześnie testowaliśmy pochodne kwasu urmotonowego i wybraliśmy kilka z nich, które przy pewnych stężeniach indukowały skośny wzrost korzeni. Związki 8, 9 i 15 zmieniały kierunek wzrostu korzeni odpowiednio przy stężeniu 75 μM, 50 μM i 40 μM, co wskazuje, że związki te mogą skutecznie destabilizować mikrotubule (rys. 2b, 6a). Testowaliśmy również najsilniejszą pochodną kwasu ursolowego, KAND 11, przy niższym stężeniu (15 µM) i stwierdziliśmy, że zastosowanie KAND 11 hamowało wzrost korzeni, a kierunek wzrostu korzeni był nierównomierny, chociaż miały tendencję do pochylania się w lewo (rysunek C3). Ponieważ wyższe stężenia leków destabilizujących mikrotubule czasami hamują wzrost rośliny, a nie powodują przechylenia korzeni, oceniliśmy następnie możliwość, że KAND 11 wpływa na mikrotubule, obserwując mikrotubule korowe w komórkach naskórka korzeni. Immunohistochemia z użyciem przeciwciał anty-β-tubulina w komórkach naskórka korzeni siewek traktowanych 25 μM KAND 11 wykazała zanik prawie wszystkich mikrotubul korowych w komórkach naskórka w strefie wydłużania (ryc. 6b). Wyniki te wskazują, że kwas kumamotonowy i jego pochodne działają bezpośrednio lub pośrednio na mikrotubule, rozrywając je, a związki te są nowymi inhibitorami mikrotubul.
Kwas ursonowy i jego pochodne zmieniają mikrotubule korowe w Arabidopsis thaliana. (a) Kąt nachylenia korzenia mierzony w obecności różnych pochodnych kwasu urmotonowego w podanych stężeniach. Przeanalizowano również działanie dwóch związków, o których wiadomo, że hamują mikrotubule: dizopiramidu i oryzaliny. Wstawka przedstawia standard stosowany do pomiaru kąta wzrostu korzenia. Gwiazdki oznaczają istotne różnice w przypadku leczenia pozorowanego (test t, p< 0,05).19. Skala = 1 cm. (b) Mikrotubule korowe w komórkach naskórka w strefie elongacji. Mikrotubule w korzeniach Arabidopsis Col dzikiego typu hodowanych na płytkach MS z 25 μM KAND 11 lub bez niego uwidoczniono za pomocą barwienia immunohistochemicznego przy użyciu przeciwciał pierwotnych β-tubuliny i przeciwciał wtórnych sprzężonych z Alexa Fluor. Skala = 10 µm. (c) Struktura mitotyczna mikrotubul w merystemie korzenia. Mikrotubule uwidoczniono za pomocą barwienia immunohistochemicznego. Struktury mitotyczne, w tym strefy profazy, wrzeciona i fragmoplasty, zliczono na podstawie obrazów konfokalnych. Strzałki wskazują struktury mikrotubul mitotycznych. Gwiazdki wskazują istotne różnice w przypadku leczenia pozorowanego (test t, p< 0,05).9. Skala = 50 µm.
Chociaż Ursa ma zdolność do zakłócania funkcji mikrotubul, oczekuje się, że jej mechanizm działania będzie inny niż typowych środków depolimeryzujących mikrotubule. Na przykład wyższe stężenia środków depolimeryzujących mikrotubule, takich jak dizopiramid i oryzalina, indukują anizotropową ekspansję komórek naskórka, podczas gdy KAND 11 tego nie robi. Ponadto, współaplikacja KAND 11 i dizopiramidu skutkowała łączną odpowiedzią wzrostu korzeni wywołaną przez dizopiramid, a zaobserwowano zahamowanie wzrostu wywołane przez KAND 11 (ryc. S4). Przeanalizowaliśmy również odpowiedź nadwrażliwego mutanta dizopiramidu 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 ma niekanoniczną punktową mutację kinazy tubuliny i wytwarza krótsze korzenie po leczeniu dizopiramidem9,20. Siewki mutantów phs1-1 wyhodowane na podłożu agarowym zawierającym KAND 11 miały krótsze korzenie, podobnie jak te wyhodowane na dizopiramidzie (ryc. S5).
Ponadto zaobserwowaliśmy struktury mikrotubul mitotycznych, takie jak strefy profazy, wrzeciona i fragmoplasty w merystemie korzeniowym sadzonek traktowanych KAND 11. Zgodnie z obserwacjami dla CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, zaobserwowano istotny spadek liczby mikrotubul mitotycznych (ryc. 6c).
Aby scharakteryzować cytotoksyczność KAND 11 w rozdzielczości subkomórkowej, poddaliśmy komórki zawiesiny tytoniu BY-2 działaniu KAND 11 i obserwowaliśmy ich reakcję. Najpierw dodaliśmy KAND 11 do komórek BY-2 wyrażających TagRFP-TUA6, który fluorescencyjnie znakuje mikrotubule, aby ocenić wpływ KAND 11 na mikrotubule korowe. Gęstość mikrotubul korowych oceniano za pomocą analizy obrazu, która określała procent pikseli cytoszkieletu wśród pikseli cytoplazmatycznych. Wyniki testu wykazały, że po leczeniu 50 μM lub 100 μM KAND 11 przez 1 godzinę gęstość znacznie spadła do 0,94 ± 0,74% lub 0,23 ± 0,28%, odpowiednio, podczas gdy gęstość komórek poddanych działaniu DMSO wyniosła 1,61 ± 0,34% (ryc. 7a). Wyniki te są zgodne z obserwacją w Arabidopsis, że traktowanie KAND 11 indukuje depolimeryzację mikrotubul korowych (ryc. 6b). Przebadaliśmy również linię BY-2 z filamentami aktynowymi znakowanymi GFP-ABD po traktowaniu tym samym stężeniem KAND 11 i zaobserwowaliśmy, że traktowanie KAND 11 rozbiło filamenty aktynowe. Traktowanie 50 μM lub 100 μM KAND 11 przez 1 h znacząco zmniejszyło gęstość filamentów aktynowych do odpowiednio 1,20 ± 0,62% lub 0,61 ± 0,26%, podczas gdy gęstość w komórkach traktowanych DMSO wynosiła 1,69 ± 0,51% (ryc. 2). 7b). Wyniki te kontrastują z efektami propyzamidu, który nie wpływa na filamenty aktynowe, i latrunkuliny B, depolimeryzatora aktyny, który nie wpływa na mikrotubule (SI Rysunek S6). Ponadto leczenie kumamonamidem 1, kwasem kumamonamidowym 6 lub KAND 11 nie wpłynęło na mikrotubule w komórkach HeLa (SI Rycina S7). Uważa się zatem, że mechanizm działania KAND 11 różni się od mechanizmu działania znanych substancji zakłócających cytoszkielet. Ponadto nasza mikroskopowa obserwacja komórek BY-2 leczonych KAND 11 ujawniła początek obumierania komórek podczas leczenia KAND 11 i pokazała, że odsetek martwych komórek barwionych błękitem Evansa nie wzrósł znacząco po 30 minutach leczenia KAND 11, podczas gdy po 90 minutach leczenia 50 μM lub 100 μM KAND liczba martwych komórek wzrosła odpowiednio do 43,7% lub 80,1% (Rycina 7c). Łącznie te dane wskazują, że nowa pochodna kwasu ursolowego KAND 11 jest roślinnym inhibitorem cytoszkieletu o nieznanym dotychczas mechanizmie działania.
KAND wpływa na mikrotubule korowe, filamenty aktynowe i żywotność komórek tytoniu BY-2. (a) Wizualizacja mikrotubul korowych w komórkach BY-2 w obecności TagRFP-TUA6. Komórki BY-2 poddane działaniu KAND 11 (50 μM lub 100 μM) lub DMSO badano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Gęstość mikrotubul korowych obliczano na podstawie mikrofotografii 25 niezależnych komórek. Litery oznaczają istotne różnice (test Tukey HSD, p< 0,05). Skala = 10 µm. (b) Włókna aktynowe kory mózgowej w komórkach BY-2 uwidocznione w obecności GFP-ABD2. Komórki BY-2 poddane działaniu KAND 11 (50 μM lub 100 μM) lub DMSO zbadano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Gęstość włókien aktynowych kory mózgowej obliczono na podstawie mikrofotografii 25 niezależnych komórek. Litery oznaczają istotne różnice (test Tukey HSD, p< 0,05). Skala = 10 µm. (c) Obserwacja martwych komórek BY-2 za pomocą barwienia błękitem Evansa. Komórki BY-2 poddane działaniu KAND 11 (50 µM lub 100 µM) lub DMSO badano za pomocą mikroskopii jasnego pola. n=3. Skala = 100 µm.
Odkrycie i zastosowanie nowych produktów naturalnych doprowadziło do znacznych postępów w różnych aspektach życia człowieka, w tym w medycynie i rolnictwie. Przeprowadzono badania historyczne w celu uzyskania użytecznych związków z zasobów naturalnych. W szczególności wiadomo, że promieniowce są przydatne jako antybiotyki przeciwpasożytnicze dla nicieni ze względu na ich zdolność do wytwarzania różnych metabolitów wtórnych, takich jak awermektyna, główny związek iwermektyny i bleomycyny oraz jej pochodnych, stosowanych w medycynie jako środek przeciwnowotworowy21,22. Podobnie odkryto różnorodne związki herbicydowe z promieniowców, z których niektóre są już stosowane komercyjnie1,23. Dlatego analiza metabolitów promieniowców w celu wyizolowania produktów naturalnych o pożądanych właściwościach biologicznych jest uważana za skuteczną strategię. W tym badaniu odkryliśmy nowy związek, kumamonamid, z S. werraensis i pomyślnie go zsyntetyzowaliśmy. Kwas ursonowy jest syntetycznym produktem pośrednim urbenamidu i jego pochodnych. Może powodować charakterystyczne zwijanie się korzeni, wykazywać umiarkowaną do silnej aktywność chwastobójczą i bezpośrednio lub pośrednio uszkadzać mikrotubule roślin. Jednak mechanizm działania kwasu urmotonowego może różnić się od mechanizmu działania istniejących inhibitorów mikrotubul, ponieważ KAND 11 również zakłóca włókna aktynowe i powoduje śmierć komórek, co sugeruje mechanizm regulacyjny, za pomocą którego kwas urmotonowy i jego pochodne wpływają na szeroki zakres struktur cytoszkieletu. .
Dalsza szczegółowa charakterystyka kwasu ursonowego pomoże lepiej zrozumieć mechanizm działania kwasu ursonowego. W szczególności kolejnym celem jest ocena zdolności kwasu ursonowego do wiązania się ze zredukowanymi mikrotubulami, aby ustalić, czy kwas ursonowy i jego pochodne działają bezpośrednio na mikrotubule i depolimeryzują je, czy też ich działanie powoduje destabilizację mikrotubul. Ponadto, w przypadku gdy mikrotubule nie są bezpośrednim celem, identyfikacja miejsca działania i celów molekularnych kwasu ursonowego na komórkach roślinnych pomoże lepiej zrozumieć właściwości pokrewnych związków i możliwe sposoby poprawy aktywności herbicydowej. Nasz test bioaktywności ujawnił wyjątkową cytotoksyczną zdolność kwasu ursonowego do wzrostu roślin, takich jak Arabidopsis thaliana, tytoń i wątrobowiec, podczas gdy ani komórki E. coli, ani HeLa nie zostały dotknięte. Niewielka lub żadna toksyczność dla komórek zwierzęcych jest zaletą pochodnych kwasu ursonowego, jeśli są one opracowywane jako herbicydy do stosowania na otwartych polach uprawnych. Rzeczywiście, ponieważ mikrotubule są powszechnymi strukturami u eukariotów, ich selektywne hamowanie w roślinach jest kluczowym wymogiem dla herbicydów. Na przykład propyzamid, środek depolimeryzujący mikrotubule, który bezpośrednio wiąże się z tubuliną i hamuje polimeryzację, jest stosowany jako herbicyd ze względu na jego niską toksyczność dla komórek zwierzęcych24. W przeciwieństwie do dizopiramidu, pokrewne benzamidy mają inną specyficzność docelową. Oprócz mikrotubul roślinnych, RH-4032 lub benzoksamid hamuje również mikrotubule komórek zwierzęcych lub lęgniowców, odpowiednio, a zalilamid jest stosowany jako fungicyd ze względu na jego niską fitotoksyczność25,26,27. Nowo odkryty miód i jego pochodne wykazują selektywną cytotoksyczność wobec roślin, ale warto zauważyć, że dalsze modyfikacje mogą zmienić ich specyficzność docelową, potencjalnie dostarczając dodatkowe pochodne do zwalczania grzybów patogennych lub lęgniowców.
Unikalne właściwości kwasu urbenonowego i jego pochodnych są przydatne do ich rozwoju jako herbicydów i wykorzystania jako narzędzi badawczych. Znaczenie cytoszkieletu w kontrolowaniu kształtu komórek roślinnych jest powszechnie znane. Wcześniejsze badania wykazały, że rośliny rozwinęły złożone mechanizmy organizacji mikrotubul korowych poprzez kontrolowanie dynamiki mikrotubul w celu prawidłowej kontroli morfogenezy. Zidentyfikowano dużą liczbę cząsteczek odpowiedzialnych za regulację aktywności mikrotubul, a powiązane badania są nadal w toku3,4,28. Nasza obecna wiedza na temat dynamiki mikrotubul w komórkach roślinnych nie wyjaśnia w pełni mechanizmów organizacji mikrotubul korowych. Na przykład, chociaż zarówno dizopiramid, jak i oryzalina mogą depolimeryzować mikrotubule, dizopiramid powoduje poważne zniekształcenie korzeni, podczas gdy oryzalina ma stosunkowo łagodny wpływ. Ponadto mutacje w tubulinie, która stabilizuje mikrotubule, również powodują prawoskrętność korzeni, podczas gdy paklitaksel, który również stabilizuje dynamikę mikrotubul, nie powoduje tego zjawiska. Dlatego badanie i identyfikacja celów molekularnych kwasu ursolowego powinny dostarczyć nowych spostrzeżeń na temat regulacji mikrotubul korowych roślin. Podobnie, przyszłe porównania substancji chemicznych, które są skuteczne w promowaniu zniekształconego wzrostu, takich jak dizopiramid, i mniej skutecznych substancji chemicznych, takich jak oryzalina lub kwas kumamotoryczny, dostarczą wskazówek, w jaki sposób dochodzi do zniekształconego wzrostu.
Z drugiej strony, przegrupowania cytoszkieletu związane z obroną są inną możliwością wyjaśnienia cytotoksyczności kwasu ursonowego. Zakażenie patogenem lub wprowadzenie elicytora do komórek roślinnych czasami powoduje zniszczenie cytoszkieletu i późniejszą śmierć komórki29. Na przykład, kryptoksantyna pochodząca z lęgniowców została zgłoszona jako zakłócająca mikrotubule i włókna aktynowe przed śmiercią komórki tytoniu, podobnie jak dzieje się to w przypadku leczenia KAND30,31. Podobieństwa między odpowiedziami obronnymi a odpowiedziami komórkowymi indukowanymi przez kwas ursonowy doprowadziły nas do hipotezy, że wyzwalają one wspólne procesy komórkowe, chociaż szybszy i silniejszy efekt kwasu ursonowego niż kryptoksantyny jest oczywisty. Jednak badania wykazały, że przerwanie włókien aktynowych promuje spontaniczną śmierć komórek, której nie zawsze towarzyszy przerwanie mikrotubul29. Ponadto pozostaje do sprawdzenia, czy patogen lub elicytor powoduje zniekształcony wzrost korzeni, tak jak robią to pochodne kwasu ursonowego. Zatem wiedza molekularna łącząca reakcje obronne i cytoszkielet jest atrakcyjnym problemem do rozwiązania. Wykorzystując obecność związków o niskiej masie cząsteczkowej związanych z kwasem ursonowym, a także szeregu pochodnych o różnych potencjałach, mogą one zapewnić możliwości ukierunkowania nieznanych mechanizmów komórkowych.
Łącznie odkrycie i zastosowanie nowych związków, które modulują dynamikę mikrotubul, zapewni potężne metody rozwiązywania złożonych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw określania kształtu komórek roślinnych. W tym kontekście niedawno opracowany związek kwasu urmotonowego, który wpływa na mikrotubule i filamenty aktynowe oraz indukuje śmierć komórek, może dać okazję do rozszyfrowania związku między kontrolą mikrotubul a tymi innymi mechanizmami. Tak więc analiza chemiczna i biologiczna z wykorzystaniem kwasu urbenonowego pomoże nam zrozumieć molekularne mechanizmy regulacyjne, które kontrolują cytoszkielet roślin.
Zaszczepić S. werraensis MK493-CF1 w 500 ml kolbie Erlenmeyera z przegrodami zawierającej 110 ml podłoża nasiennego składającego się z 2% (w/v) galaktozy, 2% (w/v) pasty Essence, 1% (w/v) kompozycji Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ekstraktu kukurydzianego (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonia), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 i 0,2% CaCO3 w wodzie dejonizowanej. (pH 7,4 przed sterylizacją). Kultury nasienne inkubowano na wytrząsarce obrotowej (180 obr./min) w temperaturze 27°C przez 2 dni. Uprawa produkcyjna poprzez fermentację w stanie stałym. Hodowlę zarodową (7 ml) przeniesiono do kolby K-1 o pojemności 500 ml zawierającej 40 g podłoża produkcyjnego składającego się z 15 g prasowanego jęczmienia (MUSO Co., Ltd., Japonia) i 25 g dejonizowanej wody (pH nie dostosowane przed sterylizacją). Fermentację prowadzono w temperaturze 30°C w ciemności przez 14 dni. Materiał fermentacyjny ekstrahowano 40 ml/butelkę EtOH i odwirowano (1500 g, 4°C, 10 min). Supernatant kultury (60 ml) ekstrahowano mieszaniną 10% MeOH/EtOAc. Warstwę organiczną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując pozostałość (59,5 mg), którą poddano chromatografii HPLC z elucją gradientową (0–10 minut: 90%) na kolumnie z odwróconą fazą (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, średnica wewnętrzna 10 mm × długość 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minut: 90% H2O/CH3CN do 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minut: 90% H2O/EtOH, 45–155 minut: 90% H2O/EtOH do 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) przy szybkości przepływu 1,5 ml/min, kumamonamid (1, 36,0 mg) wyizolowano w postaci białego amorficznego proszku.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ wartość obliczona: 141,0659, wartość zmierzona: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Nasiona Columbia (Col-0) uzyskano z Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) za zgodą na wykorzystanie w celach badawczych. Nasiona Col-0 rozmnożono i utrzymywano w naszych warunkach laboratoryjnych i wykorzystano jako rośliny Arabidopsis dzikiego typu. Nasiona Arabidopsis wysterylizowano powierzchniowo i hodowano w podłożu Murashige i Skoog o połowie mocy zawierającym 2% sacharozy (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) kwasu 2-(4-morfolino)etanosulfonowego (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) i 1,5% agaru (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, w temperaturze 23 °C i przy stałym świetle. Nasiona mutanta phs1-1 dostarczył T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Nasiona szczepu SR-1 zostały dostarczone przez T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) i użyte jako dzikie rośliny tytoniu. Nasiona tytoniu zostały wysterylizowane powierzchniowo i namoczone w sterylnej wodzie przez trzy noce, aby przyspieszyć kiełkowanie, a następnie umieszczone w roztworze o połowie mocy zawierającym 2% sacharozy, 0,05% (w/v) MES i 0,8% gumy gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige i pożywka Skoog) o pH 5,7 i inkubowane w temperaturze 23°C przy stałym świetle.
Szczep Tak-1 został dostarczony przez T. Kohchi (Uniwersytet w Kioto) i był używany jako standardowa jednostka eksperymentalna do badania wątrobowca. Gemma została uzyskana z wysterylizowanych roślin hodowlanych, a następnie posiana na podłożu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) zawierającym 1% sacharozy i 0,3% gumy gellan i inkubowana w temperaturze 23°C przy ciągłym świetle.
Komórki BY-2 tytoniu (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) zostały dostarczone przez S. Hasezawę (University of Tokyo). Komórki BY-2 rozcieńczono 95-krotnie w zmodyfikowanym podłożu Linsmeiera i Skooga i uzupełniano co tydzień kwasem 2,4-dichlorofenoksyoctowym32. Zawiesinę komórek mieszano na wytrząsarce obrotowej przy 130 obr./min w temperaturze 27°C w ciemności. Przemyto komórki 10-krotnie większą objętością świeżego podłoża i zawieszono ponownie w tym samym podłożu. Transgeniczne linie komórkowe BY-2 stabilnie wyrażające marker mikrotubul TagRFP-TUA6 lub marker filamentów aktynowych GFP-ABD2 pod promotorem wirusa mozaiki kalafiora 35S wygenerowano w sposób opisany33,34,35. Te linie komórkowe można utrzymywać i synchronizować, stosując procedury podobne do tych stosowanych w przypadku oryginalnej linii komórkowej BY-2.
Komórki HeLa hodowano w zmodyfikowanym podłożu Eagle'a Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) uzupełnionym o 10% surowicy płodowej bydlęcej, 1,2 U/ml penicyliny i 1,2 μg/ml streptomycyny w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.
Wszystkie eksperymenty opisane w niniejszym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z japońskimi przepisami i wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
Związki rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) jako roztwory wyjściowe i rozcieńczono w podłożu MS dla Arabidopsis i tytoniu lub podłożu Gamborg B5 dla wątrobowca. Do testu hamowania wzrostu korzeni, ponad 10 nasion na płytkę wysiano na podłoże agarowe zawierające wskazane związki lub DMSO. Nasiona inkubowano w komorze wzrostu przez 7 dni. Siewki sfotografowano i zmierzono długość korzeni. Do testu kiełkowania Arabidopsis, 48 nasion na płytkę wysiano na podłoże agarowe zawierające 200 μM związku lub DMSO. Nasiona Arabidopsis hodowano w komorze wzrostu, a liczbę wykiełkowanych sadzonek liczono 7 dni po kiełkowaniu (dag). Do testu kiełkowania tytoniu, 24 nasiona na płytkę wysiano na podłoże agarowe zawierające 200 μM KAND lub DMSO. Nasiona tytoniu hodowano w komorze wzrostu, a liczbę kiełkujących sadzonek liczono po 14 dniach. W celu przeprowadzenia testu zahamowania wzrostu wątrobowca 9 zarodków z każdej płytki umieszczono na podłożu agarowym zawierającym wskazane stężenia KAND lub DMSO i inkubowano w komorze wzrostu przez 14 dni.
Do uwidocznienia organizacji merystemu korzeniowego wykorzystano sadzonki barwione 5 mg/ml jodku propidyny (PI). Sygnały PI obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego TCS SPE (Leica Microsystems).
Barwienie histochemiczne korzeni β-glukuronidazą (GUS) przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym przez Malami i Benfey36. Siewki utrwalano w 90% acetonie przez noc, barwiono 0,5 mg/ml kwasu 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-d-glukuronowego w buforze GUS przez 1 godzinę i umieszczano w uwodnionym roztworze chloroaldehydu (8 g hydratu chloralu, 2 ml wody i 1 ml glicerolu) i obserwowano za pomocą mikroskopii różnicowo-interferencyjnej z użyciem mikroskopu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Kąty korzeniowe mierzono na 7-dniowych siewkach wyhodowanych na pionowo ustawionych płytkach. Zmierz kąt korzenia od kierunku wektora grawitacji, jak opisano w kroku 6.
Układ mikrotubul korowych obserwowano zgodnie z opisem, z niewielkimi modyfikacjami protokołu37. Przeciwciało przeciwko β-tubulinie (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) i sprzężone z Alexa Fluor 488 przeciwciało przeciwko mysiej IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) były używane jako przeciwciała pierwotne i wtórne w rozcieńczeniach odpowiednio 1:1000 i 1:100. Obrazy fluorescencji uzyskano przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego TCS SPE (Leica Microsystems). Uzyskaj obrazy Z-stack i utwórz projekcje o maksymalnej intensywności zgodnie z instrukcjami producenta.
Badanie proliferacji komórek HeLa przeprowadzono przy użyciu zestawu Cell Counting Kit 8 (Dojindo) zgodnie z instrukcją producenta.
Wzrost bakterii E. coli DH5α analizowano poprzez pomiar gęstości komórek w hodowli przy użyciu spektrofotometru przy 600 nm (OD600).
Organizację cytoszkieletu w transgenicznych komórkach BY-2 obserwowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w konfokalne urządzenie skanujące CSU-X1 (Yokogawa) i kamerę sCMOS (Zyla, Andor Technology). Gęstość cytoszkieletu oceniano za pomocą analizy obrazu, która określała procent pikseli cytoszkieletu wśród pikseli cytoplazmatycznych na obrazach konfokalnych przy użyciu oprogramowania ImageJ, jak opisano38,39.
Aby wykryć śmierć komórek w komórkach BY-2, alikwot zawiesiny komórek inkubowano z 0,05% błękitem Evansa przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Selektywne barwienie martwych komórek błękitem Evansa zależy od wypływu barwnika z żywych komórek przez nienaruszoną błonę plazmatyczną40. Barwione komórki obserwowano za pomocą mikroskopu jasnego pola (BX53, Olympus).
Komórki HeLa hodowano w DMEM uzupełnionym o 10% FBS w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2. Komórki traktowano 100 μM KAND 11, kwasem kumamonamowym 6, kumamonamidem 1, 100 ng/ml colcemidu (Gibco) lub 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) przez 6 godzin w temperaturze 37°C. Komórki utrwalano MetOH przez 10 minut, a następnie octanem przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Utrwalone komórki inkubowano z pierwotnym przeciwciałem β-tubuliny (1D4A4, Proteintech: 66240-1) rozcieńczonym w 0,5% BSA/PBS przez 2 godziny, przemywano 3 razy TBST, a następnie inkubowano z przeciwciałem kozim Alexa Fluor. 488 1 godzina. – Mysie IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) i 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczone w 0,5% BSA/PBS. Po trzykrotnym przemyciu TBST, barwione komórki obserwowano na odwróconym mikroskopie Nikon Eclipse Ti-E. Obrazy rejestrowano chłodzoną kamerą CCD Hamamatsu ORCA-R2 przy użyciu oprogramowania MetaMorph (Molecular Devices).
Czas publikacji: 17-06-2024