Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wyniki, zalecamy użycie nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, wyświetlamy witrynę bez stylizacji i JavaScript.
Odkrycie i korzystne wykorzystanie naturalnych produktów może pomóc w poprawie życia ludzkiego.Substancje chemiczne hamujące wzrost roślin są szeroko stosowane jako herbicydy do zwalczania chwastów.Ze względu na konieczność stosowania różnych typów herbicydów istnieje potrzeba identyfikacji związków o nowych mechanizmach działania.W tym badaniu odkryliśmy nowy związek N-alkoksypirolu, kumamonamid, ze Streptomyces werraensis MK493-CF1 i ustaliliśmy pełny proces syntezy.Dzięki testom aktywności biologicznej odkryliśmy, że kwas urs-monoaminowy jest syntetycznym półproduktem urs-monoamidu i potencjalnyminhibitor wzrostu roślin.Ponadto opracowaliśmy różne pochodne kwasu urbenonowego, w tym pochodną urbenyloksy (UDA), która wykazuje wysoką aktywność chwastobójczą, nie wpływając negatywnie na wzrost komórek HeLa.Odkryliśmy również, że pochodne kwasu urmotonowego zakłócają mikrotubule roślinne;ponadto KAND wpływa na włókna aktynowe i indukuje śmierć komórki;Te wieloaspektowe efekty różnią się od znanych inhibitorów mikrotubul i sugerują nowy mechanizm działania kwasu ursonowego, co stanowi ważną zaletę w opracowywaniu nowych herbicydów.
Odkrywanie i praktyczne zastosowanie korzystnych produktów naturalnych i ich pochodnych jest sposobem na poprawę jakości życia człowieka.Metabolity wtórne wytwarzane przez mikroorganizmy, rośliny i owady doprowadziły do ogromnego postępu w medycynie i rolnictwie.Wiele antybiotyków i leków przeciwbiałaczkowych zostało opracowanych na bazie produktów naturalnych.Ponadto różne rodzajepestycydyZ tych naturalnych produktów ekstrahuje się środki grzybobójcze i herbicydy do stosowania w rolnictwie.W szczególności herbicydy do zwalczania chwastów są ważnymi narzędziami zwiększania plonów we współczesnym rolnictwie, a różne typy związków są już stosowane komercyjnie.Za typowe cele herbicydów uważa się kilka procesów komórkowych w roślinach, takich jak fotosynteza, metabolizm aminokwasów, synteza ściany komórkowej, regulacja mitozy, sygnalizacja fitohormonalna lub synteza białek.Związki hamujące funkcję mikrotubul są powszechną klasą herbicydów wpływających na wzrost roślin poprzez wpływ na regulację mitotyczną2.
Mikrotubule są składnikami cytoszkieletu i są powszechnie konserwatywne w komórkach eukariotycznych.Heterodimer tubuliny składa się z α-tubuliny i β-tubuliny tworzących liniowe protofilamenty mikrotubul, z 13 protofilamentami tworzącymi strukturę cylindryczną.Mikrotubule odgrywają wiele ról w komórkach roślinnych, w tym określają kształt komórki, podział komórek i transport wewnątrzkomórkowy3,4.Komórki roślinne zawierają mikrotubule pod międzyfazową błoną plazmatyczną i uważa się, że te tak zwane mikrotubule korowe kontrolują organizację mikrofibryli celulozy poprzez regulację kompleksów syntazy celulozy4,5.Mikrotubule korowe komórek naskórka korzenia, obecne w strefie szybkiego wydłużania się wierzchołka korzenia, są umiejscowione bocznie, a mikrowłókna celulozowe podążają za tymi mikrotubulami i ograniczają kierunek ekspansji komórek, sprzyjając w ten sposób anizotropowemu wydłużaniu komórek.Dlatego funkcja mikrotubul jest ściśle związana z morfologią roślin.Podstawienia aminokwasów w genach kodujących tubulinę powodują wypaczenie układu mikrotubul korowych i wzrost lewo- lub prawostronny u Arabidopsis 6,7.Podobnie mutacje w białkach związanych z mikrotubulami, które regulują dynamikę mikrotubul, mogą również prowadzić do zniekształconego wzrostu korzeni8,9,10,11,12,13.Ponadto leczenie herbicydami zakłócającymi mikrotubule, takimi jak dyzopiramid, znany również jako pretilachlor, powoduje również lewostronny, skośny wzrost korzeni14.Dane te wskazują, że precyzyjna regulacja funkcji mikrotubul ma kluczowe znaczenie dla określenia kierunku wzrostu roślin.
Odkryto różne typy inhibitorów mikrotubul, które wniosły znaczący wkład w badania cytoszkieletu, a także w rolnictwie i medycynie2.W szczególności oryzalina, związki dinitroaniliny, dyzopiramid, związki pochodne benzamidu i ich analogi mogą hamować funkcję mikrotubul, a tym samym hamować wzrost roślin.Dlatego są powszechnie stosowane jako herbicydy.Ponieważ jednak mikrotubule są ważnym składnikiem komórek roślinnych i zwierzęcych, większość inhibitorów mikrotubul jest cytotoksyczna dla obu typów komórek.Dlatego też, pomimo ich uznanej przydatności jako herbicydów, w celach praktycznych stosuje się ograniczoną liczbę środków przeciwmikrotubulowych.
Streptomyces to rodzaj z rodziny Streptomyces, który obejmuje bakterie tlenowe, gram-dodatnie, nitkowate i jest powszechnie znany ze swojej zdolności do wytwarzania szerokiej gamy metabolitów wtórnych.Dlatego jest uważany za jedno z najważniejszych źródeł nowych biologicznie aktywnych produktów naturalnych.W bieżącym badaniu odkryliśmy nowy związek o nazwie kumamonamid, który wyizolowano ze Streptomyces werraensis MK493-CF1 i S. werraensis ISP 5486. Korzystając z analizy spektralnej i pełnej analizy spektralnej, scharakteryzowano strukturę kumamonamidu i jego unikalny szkielet N-alkoksypirolu był zdeterminowany.synteza.Stwierdzono, że kwas ursmonowy, syntetyczny półprodukt ursmonoamidu i jego pochodnych, hamuje wzrost i kiełkowanie popularnej rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.W badaniu zależności struktura-aktywność odkryliśmy, że związek z C9 zmodyfikowanym do kwasu ursonowego, zwany nonyloksywą pochodną kwasu ursonowego (KAND), znacząco zwiększa działanie hamujące wzrost i kiełkowanie.Warto zauważyć, że nowo odkryty inhibitor wzrostu roślin wpływał również na wzrost tytoniu i wątrobowców i nie był cytotoksyczny dla bakterii ani komórek HeLa.Co więcej, niektóre pochodne kwasu urmotonowego indukują zniekształcony fenotyp korzenia, co sugeruje, że pochodne te bezpośrednio lub pośrednio wpływają na mikrotubule.Zgodnie z tą koncepcją nasze obserwacje mikrotubul znakowanych immunohistochemicznie lub białkami fluorescencyjnymi wskazują, że leczenie KAND depolimeryzuje mikrotubule.Ponadto traktowanie pochodnymi kwasu kumamotonowego rozrywało mikrofilamenty aktynowe.W ten sposób odkryliśmy nowy inhibitor wzrostu roślin, którego unikalny mechanizm działania polega na niszczeniu cytoszkieletu.
Szczep MK493-CF1 wyizolowano z gleby w Shinagawa-ku w Tokio.Szczep MK493-CF1 utworzył dobrze rozgałęzioną grzybnię zrębową.Określono częściową sekwencję genu rybosomalnego RNA 16S (1422 bp).Szczep ten jest bardzo podobny do S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pz, T: szczep typowy, 99,93%).Na podstawie tego wyniku ustalono, że szczep ten jest blisko spokrewniony ze szczepem typu S. werraensis.Dlatego tymczasowo nazwaliśmy ten szczep S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T również wytwarza te same związki bioaktywne.Ponieważ niewiele było wczesnych badań nad uzyskaniem naturalnych produktów z tego mikroorganizmu, przeprowadzono dalsze badania chemiczne.Po hodowli S. werraensis MK493-CF1 na pożywce jęczmiennej metodą fermentacji w fazie stałej w temperaturze 30°C przez 14 dni, pożywkę ekstrahowano 50% EtOH.60 ml próbki wysuszono i otrzymano 59,5 mg surowego ekstraktu.Surowy ekstrakt poddano HPLC z odwróconymi fazami, w wyniku czego otrzymano N-metoksy-1H-pirolo-2-karboksamid (1, nazwany kumamonamidem, 36,0 mg).Całkowita ilość 1 wynosi około 60% surowego ekstraktu.Dlatego postanowiliśmy szczegółowo zbadać właściwości kumamotoamidu 1.
Kumamonamid 1 jest białym, amorficznym proszkiem, a spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości (HRESIMS) potwierdza obecność C6H8N2O2 (ryc. 1).C2-podstawiony fragment pirolowy tego związku charakteryzuje się δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH w widmie 1H NMR: 4,5 Hz , H-5) i δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), a widmo 13C NMR pokazuje obecność czterech atomów węgla sp2.Obecność grupy amidowej w pozycji C2 oceniano za pomocą korelacji HMBC od protonu C-3 do amidowego węgla karbonylowego przy δC 161,1.Ponadto piki 1H i 13C NMR przy δH 4,10 (3H, S) i δC 68,3 wskazują na obecność grup N-metoksylowych w cząsteczce.Chociaż prawidłowa pozycja grupy metoksylowej nie została jeszcze określona za pomocą analizy spektroskopowej, takiej jak spektroskopia wzmocnionej różnicy i skrót jądrowy Overhausera (NOEDF), pierwszym związkiem kandydującym stał się N-metoksy-1H-pirolo-2-karboksamid.
Aby określić prawidłową strukturę 1, przeprowadzono syntezę całkowitą (ryc. 2a).Traktowanie dostępnej w handlu 2-aminopirydyny 2 m-CPBA dało odpowiedni N-tlenek 3 z wydajnością ilościową.Po 2-aminoazydowaniu 2, reakcję cyklokondensacji opisaną przez Abramowicza przeprowadzono w benzenie w temperaturze 90°C, otrzymując żądany 1-hydroksy-1H-pirolo-2-karbonitryl w ilości 5 gramów.Prędkość 60% (dwa etapy).15,16.Następnie metylacja i hydroliza 4 dała kwas 1-metoksy-1H-pirolo-2-karboksylowy (określany jako „kwas kumotonowy”, 6) z dobrą wydajnością (70%, dwa etapy).Na koniec, amidowanie za pomocą chlorku kwasowego, związku pośredniego 6, przy użyciu wodnego roztworu amoniaku dało Kumamoto amid 1 z wydajnością 98%.Wszystkie dane spektralne zsyntetyzowanego 1 były podobne do wyizolowanego 1, więc określono strukturę 1;
Ogólna synteza i analiza aktywności biologicznej urbenamidu i kwasu urbenowego.(a) Całkowita synteza amidu Kumamoto.(b) Siedmiodniowe sadzonki Arabidopsis Columbia (Col) typu dzikiego hodowano na płytkach Murashige i Skoog (MS) zawierających kumamonamid 6 lub kumamonamid 1 we wskazanych stężeniach.Pasek skali = 1 cm.
Najpierw oceniliśmy aktywność biologiczną urbenamidu i jego półproduktów pod kątem ich zdolności do modulowania wzrostu roślin.Do podłoża agarowego MS dodaliśmy ursmonamid 1 lub kwas ursmonowy 6 w różnym stężeniu i na tym podłożu hodowaliśmy sadzonki Arabidopsis thaliana.Testy te wykazały, że wysokie stężenia (500 µM) 6 hamowały wzrost korzeni (ryc. 2b).Następnie wygenerowaliśmy różne pochodne, podstawiając pozycję N1 6 i przeprowadziliśmy na nich badania zależności struktura-aktywność (proces syntezy analogowej opisano w informacjach pomocniczych (SI)).Sadzonki Arabidopsis hodowano na podłożu zawierającym 50 µM pochodnych kwasu ursonowego i mierzono długość korzeni.jak pokazano na obrazku.Jak pokazano na rysunkach 3a, b i S1, kwasy kuumamo mają różną długość liniowych łańcuchów alkoksylowych (9, 10, 11, 12 i 13) lub dużych łańcuchów alkoksylowych (15, 16 i 17) w pozycji N1.Pochodne wykazały istotne hamowanie wzrostu korzeni.Ponadto odkryliśmy, że zastosowanie 200 μM 10, 11 lub 17 hamuje kiełkowanie (ryc. 3c i S2).
Badanie zależności struktura-aktywność amidu Kumamoto i związków pokrewnych.(a) Struktura i schemat syntezy analogów.( b ) Kwantyfikacja długości korzeni 7-dniowych sadzonek hodowanych na pożywce MS z dodatkiem lub bez 50 µM pochodnych kuumamonamidu.Gwiazdki wskazują istotne różnice w przypadku leczenia pozorowanego (test t, s< 0,05).n>18. Dane przedstawiono jako średnią ± SD.nt oznacza „nietestowane”, ponieważ ponad 50% nasion nie wykiełkowało.(c) Kwantyfikacja szybkości kiełkowania zaprawionych nasion inkubowanych przez 7 dni w pożywce MS z dodatkiem lub bez 200 µM kuumamonamidu i związków pokrewnych.Gwiazdki wskazują istotne różnice w przypadku leczenia pozorowanego (test chi-kwadrat).n=96.
Co ciekawe, dodatek alkilowych łańcuchów bocznych dłuższych niż C9 zmniejszył działanie hamujące, co sugeruje, że związki pokrewne kwasowi kumamotojowemu wymagają łańcuchów bocznych o określonej wielkości, aby wykazać swoją aktywność biologiczną.
Ponieważ analiza zależności struktura-aktywność wykazała, że C9 został zmodyfikowany do kwasu ursonowego, a nonyloksywa pochodna kwasu ursonowego (zwana dalej KAND 11) była najskuteczniejszym inhibitorem wzrostu roślin, przeprowadziliśmy bardziej szczegółową charakterystykę KAND 11. Leczenie Arabidopsis z 50 µM KAND 11 prawie całkowicie zapobiegało kiełkowaniu, natomiast niższe stężenia (40, 30, 20 lub 10 µM) KAND 11 hamowały wzrost korzeni w sposób zależny od dawki (ryc. 4a, b).Aby sprawdzić, czy KAND 11 wpływa na żywotność merystemu korzenia, zbadaliśmy merystemy korzeni wybarwione jodkiem propidyny (PI) i zmierzyliśmy wielkość obszaru merystemu.Wielkość merystemu sadzonek wyhodowanych na podłożu zawierającym 25 µM KAND-11 wynosiła 151,1 ± 32,5 µm, natomiast wielkość merystemu sadzonek wyhodowanych na podłożu kontrolnym zawierającym DMSO wyniosła 264,7 ± 30,8 µm (ryc. 4c, d) , co wskazuje, że KAND-11 przywraca aktywność komórkową.rozpościerający się.Merystem korzenia.Zgodnie z tym leczenie KAND 11 zmniejszyło ilość sygnału markera podziału komórkowego CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS w merystemie korzenia (ryc. 4e) 17 .Wyniki te wskazują, że KAND 11 hamuje wzrost korzeni poprzez zmniejszenie aktywności proliferacji komórek.
Analiza hamującego wpływu pochodnych kwasu urbenonowego (pochodnych urbenyloksylowych) na wzrost.(a) 7-dniowe sadzonki Col typu dzikiego hodowane na płytkach MS ze wskazanymi stężeniami KAND 11. Pasek skali = 1 cm.(b) Kwantyfikacja długości korzenia.Litery wskazują istotne różnice (test Tukeya HSD, s< 0,05).n>16. Dane przedstawiono jako średnią ± SD.( c ) Mikroskopia konfokalna korzeni Col typu dzikiego barwionych jodkiem propidyny, hodowanych na płytkach MS z lub bez 25 µM KAND 11. Białe nawiasy wskazują merystem korzenia.Pasek skali = 100 µm.(d) Kwantyfikacja wielkości merystemu korzenia (n = 10 do 11).Różnice statystyczne określono za pomocą testu t (p< 0,05).Słupki przedstawiają średni rozmiar merystemu.(e) Mikroskopia różnicowo-interferencyjna (DIC) merystemu korzenia zawierającego konstrukt CDKB2;1pro: CDKB2;Wybarwiono 1-GUS i wybarwiono 5-dniowe sadzonki hodowane na płytkach MS z lub bez 25 µM testu KAND.
Fitotoksyczność KAND 11 badano dalej, stosując inną roślinę dwuliścienną, tytoń (Nicotiana tabacum) i główny organizm modelowy rośliny lądowej, wątrobowiec (Marchantia Polymorpha).Podobnie jak w przypadku Arabidopsis, siewki tytoniu SR-1 hodowane na podłożu zawierającym 25 µM KAND 11 wytworzyły krótsze korzenie (ryc. 5a).Dodatkowo 40 z 48 nasion wykiełkowało na płytkach zawierających 200 µM KAND 11, podczas gdy wszystkie 48 nasion wykiełkowało na pożywce traktowanej pozornie, co wskazuje, że wyższe stężenia KAND były istotne (p< 0,05;test chi -kwadrat) hamował kiełkowanie tytoniu.(ryc. 5b).Ponadto stężenie KAND 11 hamujące rozwój bakterii w wątrobowcu było podobne do skutecznego stężenia w Arabidopsis (ryc. 5c).Wyniki te wskazują, że KAND 11 może hamować wzrost różnych roślin.Następnie zbadaliśmy możliwą cytotoksyczność związków związanych z monoamidem niedźwiedzia w innych organizmach, a mianowicie ludzkich komórkach HeLa i szczepie Escherichia coli DH5α, jako przedstawicieli odpowiednio wyższych komórek zwierzęcych i bakteryjnych.W serii testów proliferacji komórek zaobserwowaliśmy, że kumamonamid 1, kwas kuumamonamidowy 6 i KAND 11 nie wpływają na wzrost komórek HeLa lub E. coli w stężeniach 100 µM (ryc. 5d, e).
Hamowanie wzrostu KAND 11 w organizmach innych niż Arabidopsis.(a) Dwutygodniowe sadzonki tytoniu SR-1 typu dzikiego hodowano na ustawionych pionowo płytkach MS zawierających 25 µM KAND 11. (b) Dwutygodniowe sadzonki tytoniu SR-1 typu dzikiego hodowano na ustawionych poziomo Płytki MS zawierające 200 µM KAND 11. ( c) Dwutygodniowe pąki wątrobowca Tak-1 typu dzikiego, hodowane na płytkach Gamborg B5 ze wskazanymi stężeniami KAND 11. Czerwone strzałki wskazują zarodniki, które przestały rosnąć w ciągu dwutygodniowej inkubacji okres.(d) Test proliferacji komórek HeLa.Liczbę żywotnych komórek mierzono w ustalonych odstępach czasu przy użyciu zestawu do liczenia komórek 8 (Dojindo).Jako kontrolę komórki HeLa traktowano 5 µg/ml aktynomycyny D (Act D), która hamuje transkrypcję polimerazy RNA i powoduje śmierć komórki.Analizy przeprowadzono trzykrotnie.(e) Test proliferacji komórek E. coli.Wzrost E. coli analizowano poprzez pomiar OD600.Jako kontrolę komórki traktowano 50 µg/ml ampicyliny (Amp), która hamuje syntezę ściany komórkowej bakterii.Analizy przeprowadzono trzykrotnie.
Aby rozszyfrować mechanizm działania cytotoksyczności wywołanej przez związki pochodne uramidu, ponownie przeanalizowaliśmy pochodne kwasu urbenowego o umiarkowanym działaniu hamującym.jak pokazano na obrazku.Jak pokazano na rycinach 2b, 6a, siewki wyhodowane na płytkach agarowych zawierających wysokie stężenia (200 µM) kwasu urmotonowy 6 wytworzyły korzenie krótsze i zakrzywione w lewo (θ = – 23,7 ± 6,1), natomiast w przypadku sadzonek wyhodowanych na pożywce kontrolnej siewki wytworzyły prawie proste korzenie (θ = – 3,8 ± 7,1).Wiadomo, że ten charakterystyczny ukośny wzrost wynika z dysfunkcji mikrotubul korowych14,18.Zgodnie z tym odkryciem, leki destabilizujące mikrotubule, dizopiramid i oryzalina, indukowały podobne przechylenie korzeni w naszych warunkach wzrostu (ryc. 2b, 6a).Jednocześnie przetestowaliśmy pochodne kwasu urmotonowego i wybraliśmy kilka z nich, które w określonych stężeniach indukowały ukośny wzrost korzeni.Związki 8, 9 i 15 zmieniły kierunek wzrostu korzenia odpowiednio przy 75 µM, 50 µM i 40 µM, co wskazuje, że związki te mogą skutecznie destabilizować mikrotubule (ryc. 2b, 6a).Przetestowaliśmy także najsilniejszą pochodną kwasu ursolowego, KAND 11, w niższym stężeniu (15 µM) i odkryliśmy, że zastosowanie KAND 11 hamuje wzrost korzeni, a kierunek wzrostu korzeni jest nierówny, chociaż mają one tendencję do pochylania się w lewo ( Rysunek C3)..Ponieważ wyższe stężenia leków destabilizujących mikrotubule czasami hamują wzrost roślin, a nie powodują przechylenie korzeni, następnie oceniliśmy możliwość wpływu KAND 11 na mikrotubule, obserwując mikrotubule korowe w komórkach naskórka korzeni.Immunohistochemia z użyciem przeciwciał przeciwko β-tubulinie w komórkach naskórka korzeni siewek traktowanych 25 µM KAND 11 wykazała zanik prawie wszystkich mikrotubul korowych w komórkach naskórka w strefie elongacji (ryc. 6b).Wyniki te wskazują, że kwas kumamotonowy i jego pochodne działają bezpośrednio lub pośrednio na mikrotubule, rozrywając je, oraz że związki te są nowymi inhibitorami mikrotubul.
Kwas ursonowy i jego pochodne zmieniają mikrotubule korowe u Arabidopsis thaliana.(a) Kąt nachylenia korzeni mierzony w obecności różnych pochodnych kwasu urmotonowy we wskazanych stężeniach.Przeanalizowano także działanie dwóch związków hamujących mikrotubule: dyzopiramidu i oryzaliny.Wstawka przedstawia standard stosowany do pomiaru kąta wzrostu korzeni.Gwiazdki wskazują istotne różnice w przypadku leczenia pozorowanego (test t, s< 0,05).n>19. Pasek skali = 1 cm.(b) Mikrotubule korowe w komórkach naskórka w strefie elongacji.Mikrotubule w korzeniach Arabidopsis Col typu dzikiego hodowanych na płytkach MS z lub bez 25 µM KAND 11 wizualizowano za pomocą barwienia immunohistochemicznego przy użyciu pierwotnych przeciwciał przeciwko β-tubulinie i wtórnych przeciwciał skoniugowanych z Alexa Fluor.Pasek skali = 10 µm.(c) Struktura mitotyczna mikrotubul w merystemie korzenia.Mikrotubule uwidoczniono za pomocą barwienia immunohistochemicznego.Struktury mitotyczne, w tym strefy profazy, wrzeciona i fragmoplasty, policzono na podstawie obrazów konfokalnych.Strzałki wskazują mitotyczne struktury mikrotubul.Gwiazdki wskazują istotne różnice w przypadku leczenia pozorowanego (test t, s< 0,05).n>9. Pasek skali = 50 µm.
Chociaż Ursa ma zdolność zakłócania funkcji mikrotubul, oczekuje się, że jej mechanizm działania będzie inny niż w przypadku typowych środków depolimeryzujących mikrotubule.Na przykład wyższe stężenia środków depolimeryzujących mikrotubule, takich jak dyzopiramid i oryzalina, indukują anizotropową ekspansję komórek naskórka, podczas gdy KAND 11 nie.Ponadto jednoczesne zastosowanie KAND 11 i dyzopiramidu spowodowało połączoną odpowiedź na wzrost korzeni indukowaną dizopiramidem i zaobserwowano hamowanie wzrostu indukowane przez KAND 11 (ryc. S4).Przeanalizowaliśmy także odpowiedź nadwrażliwego mutanta dizopiramidu 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 ma niekanoniczną mutację punktową kinazy tubulinowej i wytwarza krótsze korzenie po leczeniu dizopiramidem9,20.Siewki z mutacją phs1-1 hodowane na podłożu agarowym zawierającym KAND 11 miały krótsze korzenie podobne do tych rosnących na dyzopiramidzie (ryc. S5).
Ponadto zaobserwowaliśmy mitotyczne struktury mikrotubul, takie jak strefy profazy, wrzeciona i fragmoplasty, w merystemie korzenia sadzonek traktowanych KAND 11. Zgodnie z obserwacjami dla CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, znaczny spadek zaobserwowano liczbę mikrotubul mitotycznych (ryc. 6c).
Aby scharakteryzować cytotoksyczność KAND 11 w rozdzielczości subkomórkowej, traktowaliśmy komórki zawiesiny tytoniu BY-2 za pomocą KAND 11 i obserwowaliśmy ich odpowiedź.Najpierw dodaliśmy KAND 11 do komórek BY-2 wyrażających TagRFP-TUA6, który fluorescencyjnie znakuje mikrotubule, aby ocenić wpływ KAND 11 na mikrotubule korowe.Gęstość mikrotubul korowych oceniano za pomocą analizy obrazu, która określała ilościowo odsetek pikseli cytoszkieletowych wśród pikseli cytoplazmatycznych.Wyniki testu wykazały, że po traktowaniu 50 µM lub 100 µM KAND 11 przez 1 godzinę gęstość znacząco spadła odpowiednio do 0,94 ± 0,74% lub 0,23 ± 0,28%, natomiast gęstość komórek traktowanych DMSO wyniosła 1,61 ± 0,34 % (ryc. 7a).Wyniki te są zgodne z obserwacją Arabidopsis, że leczenie KAND 11 indukuje depolimeryzację mikrotubul korowych (ryc. 6b).Zbadaliśmy także linię BY-2 z włóknami aktynowymi znakowanymi GFP-ABD po traktowaniu KAND 11 o tym samym stężeniu i zaobserwowaliśmy, że traktowanie KAND 11 rozrywało włókna aktynowe.Traktowanie 50 µM lub 100 µM KAND 11 przez 1 godzinę znacząco zmniejszyło gęstość włókien aktynowych odpowiednio do 1,20 ± 0,62% lub 0,61 ± 0,26%, podczas gdy gęstość w komórkach traktowanych DMSO wynosiła 1,69 ± 0,51% (ryc. 2).7b).Wyniki te kontrastują z działaniem propyzamidu, który nie wpływa na włókna aktynowe, i latrunkuliny B, depolimeryzatora aktyny, który nie wpływa na mikrotubule (SI Rysunek S6).Ponadto leczenie kuumamonamidem 1, kwasem kumamonamidowym 6 lub KAND 11 nie miało wpływu na mikrotubule w komórkach HeLa (rysunek SI S7).Zatem uważa się, że mechanizm działania KAND 11 różni się od znanych czynników zakłócających cytoszkielet.Ponadto nasza mikroskopowa obserwacja komórek BY-2 traktowanych KAND 11 ujawniła początek śmierci komórek podczas leczenia KAND 11 i wykazała, że odsetek martwych komórek wybarwionych na niebiesko Evansa nie wzrósł znacząco po 30 minutach leczenia KAND 11, podczas gdy po 90 minutach leczenia 50 µM lub 100 µM KAND liczba martwych komórek wzrosła odpowiednio do 43,7% lub 80,1% (ryc. 7c).Podsumowując, dane te wskazują, że nowa pochodna kwasu ursolowego KAND 11 jest specyficznym dla roślin inhibitorem cytoszkieletu o nieznanym wcześniej mechanizmie działania.
KAND wpływa na mikrotubule korowe, włókna aktynowe i żywotność komórek BY-2 tytoniu.( a ) Wizualizacja mikrotubul korowych w komórkach BY-2 w obecności TagRFP-TUA6.Komórki BY-2 traktowane KAND 11 (50 µM lub 100 µM) lub DMSO badano za pomocą mikroskopii konfokalnej.Gęstość mikrotubul korowych obliczono na podstawie mikrofotografii 25 niezależnych komórek.Litery wskazują istotne różnice (test Tukeya HSD, s< 0,05).Pasek skali = 10 µm.( b ) Korowe włókna aktynowe w komórkach BY-2 wizualizowane w obecności GFP-ABD2.Komórki BY-2 traktowane KAND 11 (50 µM lub 100 µM) lub DMSO badano za pomocą mikroskopii konfokalnej.Gęstość korowych włókien aktynowych obliczono na podstawie mikrofotografii 25 niezależnych komórek.Litery wskazują istotne różnice (test Tukeya HSD, s< 0,05).Pasek skali = 10 µm.(c) Obserwacja martwych komórek BY-2 za pomocą barwienia błękitem Evansa.Komórki BY-2 traktowane KAND 11 (50 µM lub 100 µM) lub DMSO badano za pomocą mikroskopii w jasnym polu.n=3.Pasek skali = 100 µm.
Odkrycie i zastosowanie nowych produktów naturalnych doprowadziło do znacznego postępu w różnych aspektach życia człowieka, w tym w medycynie i rolnictwie.Przeprowadzono badania historyczne w celu uzyskania użytecznych związków z zasobów naturalnych.W szczególności wiadomo, że promieniowce są przydatne jako antybiotyki przeciwpasożytnicze dla nicieni ze względu na ich zdolność do wytwarzania różnych metabolitów wtórnych, takich jak awermektyna, główny związek iwermektyny i bleomycyna oraz jej pochodne, stosowane w medycynie jako środek przeciwnowotworowy21,22.Podobnie odkryto różnorodne związki chwastobójcze z promieniowców, a niektóre z nich są już stosowane komercyjnie1,23.Dlatego też analizę metabolitów promieniowców w celu wyizolowania produktów naturalnych o pożądanych aktywnościach biologicznych uważa się za skuteczną strategię.W tym badaniu odkryliśmy nowy związek, kumamonamid, z S. werraensis i pomyślnie go zsyntetyzowaliśmy.Kwas ursonowy jest syntetycznym półproduktem urbenamidu i jego pochodnych.Może powodować charakterystyczne zwijanie się korzeni, wykazywać umiarkowane do silnego działania chwastobójczego oraz bezpośrednio lub pośrednio uszkadzać mikrotubule roślin.Jednakże mechanizm działania kwasu urmotonowy może różnić się od istniejących inhibitorów mikrotubul, ponieważ KAND 11 niszczy również włókna aktynowe i powoduje śmierć komórek, co sugeruje mechanizm regulacyjny, za pomocą którego kwas urmotonowy i jego pochodne wpływają na szeroki zakres struktur cytoszkieletowych..
Dalsza szczegółowa charakterystyka kwasu urbenonowego pomoże lepiej zrozumieć mechanizm działania kwasu urbenonowego.W szczególności kolejnym celem jest ocena zdolności kwasu ursonowego do wiązania się ze zredukowanymi mikrotubulami w celu określenia, czy kwas ursonowy i jego pochodne działają bezpośrednio na mikrotubule i je depolimeryzują, czy też ich działanie powoduje destabilizację mikrotubul.Ponadto w przypadku, gdy mikrotubule nie są bezpośrednim celem, identyfikacja miejsca działania i celów molekularnych kwasu ursonowego na komórkach roślinnych pomoże lepiej zrozumieć właściwości pokrewnych związków i możliwe sposoby poprawy działania chwastobójczego.Nasz test bioaktywności ujawnił wyjątkową zdolność cytotoksyczną kwasu ursonowego na wzrost roślin, takich jak Arabidopsis thaliana, tytoń i wątrobowiec, przy czym nie miał on wpływu na komórki E. coli ani HeLa.Zaletą pochodnych kwasu ursonowego jest niewielka lub żadna toksyczność dla komórek zwierzęcych, jeśli są one opracowywane jako herbicydy do stosowania na otwartych polach uprawnych.Rzeczywiście, ponieważ mikrotubule są powszechnymi strukturami u eukariontów, ich selektywne hamowanie w roślinach jest kluczowym wymogiem w przypadku herbicydów.Na przykład propyzamid, środek depolimeryzujący mikrotubule, który bezpośrednio wiąże się z tubuliną i hamuje polimeryzację, jest stosowany jako herbicyd ze względu na jego niską toksyczność dla komórek zwierzęcych24.W przeciwieństwie do dyzopiramidu, pokrewne benzamidy mają inną specyficzność docelową.Oprócz mikrotubul roślinnych, RH-4032 lub benzoksamid hamują również odpowiednio mikrotubule komórek zwierzęcych lub lęgniowców, a zalilamid jest stosowany jako środek grzybobójczy ze względu na jego niską fitotoksyczność25,26,27.Nowo odkryty niedźwiedź i jego pochodne wykazują selektywną cytotoksyczność wobec roślin, warto jednak zauważyć, że dalsze modyfikacje mogą zmienić ich specyficzność docelową, potencjalnie dostarczając dodatkowych pochodnych do zwalczania patogennych grzybów lub lęgniowców.
Unikalne właściwości kwasu urbenonowego i jego pochodnych są przydatne do ich opracowania jako herbicydów i wykorzystania jako narzędzia badawcze.Powszechnie uznaje się znaczenie cytoszkieletu w kontrolowaniu kształtu komórki roślinnej.Wcześniejsze badania wykazały, że u roślin wyewoluowały złożone mechanizmy organizacji mikrotubul korowych poprzez kontrolowanie dynamiki mikrotubul w celu właściwej kontroli morfogenezy.Zidentyfikowano dużą liczbę cząsteczek odpowiedzialnych za regulację aktywności mikrotubul, a badania w tym zakresie wciąż trwają3,4,28.Nasze obecne zrozumienie dynamiki mikrotubul w komórkach roślinnych nie wyjaśnia w pełni mechanizmów organizacji mikrotubul korowych.Na przykład, chociaż zarówno dyzopiramid, jak i oryzalina mogą depolimeryzować mikrotubule, dyzopiramid powoduje poważne zniekształcenie korzenia, podczas gdy oryzalina ma stosunkowo łagodne działanie.Co więcej, mutacje w tubulinie, która stabilizuje mikrotubule, również powodują prawoskrętność w korzeniach, podczas gdy paklitaksel, który również stabilizuje dynamikę mikrotubul, nie.Dlatego badanie i identyfikacja celów molekularnych kwasu ursolowego powinno dostarczyć nowych informacji na temat regulacji mikrotubul korowych roślin.Podobnie przyszłe porównania substancji chemicznych skutecznych w promowaniu zaburzonego wzrostu, takich jak dyzopiramid, i mniej skutecznych substancji chemicznych, takich jak oryzalin lub kwas kumamotorowy, dostarczą wskazówek, jak dochodzi do zniekształconego wzrostu.
Z drugiej strony rearanżacje cytoszkieletu związane z obroną to kolejna możliwość wyjaśnienia cytotoksyczności kwasu ursonowego.Zakażenie patogenem lub wprowadzenie elicytora do komórek roślinnych powoduje czasami zniszczenie cytoszkieletu i następczą śmierć komórki29.Na przykład donoszono, że kryptoksantyna pochodząca z omycetes zakłóca mikrotubule i włókna aktynowe przed śmiercią komórek tytoniu, podobnie jak w przypadku leczenia KAND30,31.Podobieństwa między reakcjami obronnymi a odpowiedziami komórkowymi indukowanymi przez kwas ursonowy skłoniły nas do postawienia hipotezy, że uruchamiają one typowe procesy komórkowe, chociaż oczywiste jest szybsze i silniejsze działanie kwasu ursonowego niż kryptoksantyny.Jednakże badania wykazały, że rozerwanie włókien aktynowych sprzyja spontanicznej śmierci komórek, której nie zawsze towarzyszy rozerwanie mikrotubul29.Ponadto okaże się, czy patogen lub elicytor powodują zniekształcony wzrost korzeni, tak jak dzieje się to w przypadku pochodnych kwasu ursonowego.Zatem wiedza molekularna łącząca reakcje obronne i cytoszkielet stanowi atrakcyjny problem, którym należy się zająć.Wykorzystując obecność związków o niskiej masie cząsteczkowej związanych z kwasem ursonowym, a także szeregu pochodnych o różnej mocy, mogą zapewnić możliwości ukierunkowania nieznanych mechanizmów komórkowych.
Podsumowując, odkrycie i zastosowanie nowych związków modulujących dynamikę mikrotubul zapewni skuteczne metody badania złożonych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw określania kształtu komórek roślinnych.W tym kontekście niedawno opracowany związek kwasu urmotonowy, który wpływa na mikrotubule i włókna aktynowe oraz indukuje śmierć komórek, może zapewnić możliwość rozszyfrowania powiązania między kontrolą mikrotubul a tymi innymi mechanizmami.Zatem analiza chemiczna i biologiczna z wykorzystaniem kwasu urbenonowego pomoże nam zrozumieć molekularne mechanizmy regulacyjne kontrolujące cytoszkielet roślinny.
Zaszczepić S. werraensis MK493-CF1 do 500 ml kolby Erlenmeyera z przegrodami, zawierającej 110 ml podłoża posiewowego składającego się z 2% (w/v) galaktozy, 2% (w/v) pasty esencji, 1% (w/v) Kompozycji Bacto .- soja (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ekstrakt z kukurydzy (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonia), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 i 0,2% CaCO3 w wodzie dejonizowanej.(pH 7,4 przed sterylizacją).Hodowle posiewowe inkubowano na wytrząsarce obrotowej (180 obr/min) w temperaturze 27°C przez 2 dni.Uprawa produkcyjna poprzez fermentację w stanie stałym.Hodowlę posiewową (7 ml) przeniesiono do kolby K-1 o pojemności 500 ml zawierającej 40 g pożywki produkcyjnej składającej się z 15 g prasowanego jęczmienia (MUSO Co., Ltd., Japonia) i 25 g wody dejonizowanej (pH nie dostosowane przed sterylizacją).).Fermentację prowadzono w temperaturze 30°C w ciemności przez 14 dni.Materiał fermentacyjny ekstrahowano 40 ml/butelkę EtOH i odwirowano (1500 g, 4°C, 10 min).Supernatant hodowli (60 ml) ekstrahowano mieszaniną 10% MeOH/EtOAc.Warstwę organiczną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pozostałość (59,5 mg), którą poddano HPLC z elucją gradientową (0–10 minut: 90%) na kolumnie z odwróconymi fazami (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 µm, ID 10 mm × długość 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minut: 90% H2O/CH3CN do 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minut: 90% H2O/EtOH, 45–155 minut: 90% H2O /EtOH do 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) przy natężeniu przepływu 1,5 ml/min, kumamonamid (1, 36,0 mg) wyizolowano w postaci białego bezpostaciowego proszku.
Kumamotoamid (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCI3) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ wartość obliczona: 141,0659, wartość zmierzona: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Nasiona Columbia (Col-0) uzyskano z Centrum Zasobów Biologicznych Arabidopsis (ABRC) za pozwoleniem na wykorzystanie badawcze.Nasiona Col-0 rozmnażano i utrzymywano w naszych warunkach laboratoryjnych i wykorzystano jako rośliny Arabidopsis typu dzikiego.Nasiona Arabidopsis sterylizowano powierzchniowo i hodowano na pożywce Murashige i Skoog o połowie mocy zawierającej 2% sacharozy (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) kwasu 2-(4-morfolino)etanosulfonowego (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) i 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, w temperaturze 23°C i przy stałym świetle.Nasiona mutanta phs1-1 dostarczył T. Hashimoto (Instytut Nauki i Technologii Nara).
Nasiona szczepu SR-1 dostarczył T. Hashimoto (Instytut Nauki i Technologii Nara) i wykorzystano je jako rośliny tytoniu typu dzikiego.Nasiona tytoniu poddano sterylizacji powierzchniowej i moczono w sterylnej wodzie przez trzy noce w celu przyspieszenia kiełkowania, a następnie umieszczono w roztworze o połowie mocy zawierającym 2% sacharozy, 0,05% (w/v) MES i 0,8% gumy gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical). Murashige.i podłoże Skooga) o pH 5,7 i inkubowano w temperaturze 23°C przy stałym świetle.
Szczep Tak-1 został dostarczony przez T. Kohchi (Uniwersytet w Kioto) i został użyty jako standardowa jednostka eksperymentalna w badaniach wątrobowca.Gemmę otrzymano ze sterylizowanych hodowanych roślin, a następnie wysiano na pożywkę Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) zawierającą 1% sacharozy i 0,3% gumy gellan i inkubowano w temperaturze 23°C w ciągłym świetle.
Komórki tytoniu BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) dostarczył S. Hasezawa (Uniwersytet Tokijski).Komórki BY-2 rozcieńczono 95-krotnie w zmodyfikowanej pożywce Linsmeiera i Skooga i co tydzień uzupełniano kwasem 2,4-dichlorofenoksyoctowym 32 .Zawiesinę komórek mieszano na wytrząsarce obrotowej przy 130 obr./min. w temperaturze 27°C w ciemności.Przemyć komórki 10-krotną objętością świeżej pożywki i ponownie zawiesić w tej samej pożywce.Transgeniczne linie komórkowe BY-2 stabilnie eksprymujące marker mikrotubul TagRFP-TUA6 lub marker włókna aktynowego GFP-ABD2 pod promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora wygenerowano zgodnie z opisem33,34,35.Te linie komórkowe można utrzymywać i synchronizować przy użyciu procedur podobnych do tych stosowanych w przypadku oryginalnej linii komórkowej BY-2.
Komórki HeLa hodowano w pożywce Eagle'a modyfikowanej Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1,2 U/ml penicyliny i 1,2 μg/ml streptomycyny w inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO2.
Wszystkie eksperymenty opisane w tym manuskrypcie przeprowadzono zgodnie z japońskimi przepisami i wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
Związki rozpuszczono w sulfotlenku dimetylu (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) jako roztwory podstawowe i rozcieńczono w pożywce MS dla Arabidopsis i tytoniu lub pożywce Gamborg B5 dla wątrobowca.Do testu hamowania wzrostu korzeni, ponad 10 nasion na płytkę wysiano na pożywkę agarową zawierającą wskazane związki lub DMSO.Nasiona inkubowano w komorze wzrostowej przez 7 dni.Sadzonki fotografowano i mierzono długość korzeni.Do testu kiełkowania Arabidopsis, 48 nasion na płytkę wysiano na pożywce agarowej zawierającej 200 µM związku lub DMSO.Nasiona Arabidopsis hodowano w komorze wzrostowej i liczono liczbę kiełkujących sadzonek po 7 dniach od kiełkowania (dag).Do testu kiełkowania tytoniu, 24 nasiona na płytkę wysiano na pożywce agarowej zawierającej 200 µM KAND lub DMSO.Nasiona tytoniu hodowano w komorze wzrostowej, a po 14 dniach liczono liczbę kiełkujących sadzonek.Do testu hamowania wzrostu wątrobowca, 9 zarodków z każdej płytki wysiano na pożywkę agarową zawierającą KAND lub DMSO we wskazanych stężeniach i inkubowano w komorze wzrostowej przez 14 dni.
Użyj sadzonek wybarwionych 5 mg/ml jodku propidyny (PI), aby uwidocznić organizację merystemu korzenia.Sygnały PI obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego TCS SPE (Leica Microsystems).
Barwienie histochemiczne korzeni β-glukuronidazą (GUS) przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym przez Malamiego i Benfeya36.Siewki utrwalono w 90% acetonie przez noc, wybarwiono 0,5 mg/ml kwasu 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-d-glukuronowego w buforze GUS na 1 godzinę i umieszczono w uwodnionym roztworze aldehydu chlorowego.(8 g hydratu chloralu, 2 ml wody i 1 ml gliceryny) i obserwowano za pomocą różnicowej mikroskopii kontrastowo-interferencyjnej przy użyciu mikroskopu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Kąty korzeniowe mierzono na 7-dniowych sadzonkach wyhodowanych na pionowo ustawionych płytkach.Zmierz kąt podstawy od kierunku wektora grawitacji, jak opisano w kroku 6.
Obserwowano układ mikrotubul korowych zgodnie z opisem, z niewielkimi modyfikacjami protokołu 37 .Jako przeciwciała pierwotne i wtórne zastosowano przeciwciała anty-β-tubuliny (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) i przeciwciała anty-mysie IgG skoniugowane z Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) jako przeciwciała pierwotne i wtórne w rozcieńczeniach 1:1000 i 1:100, odpowiednio.Obrazy fluorescencyjne uzyskano przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego TCS SPE (Leica Microsystems).Pozyskuj obrazy w formacie Z i twórz projekcje o maksymalnej intensywności zgodnie z instrukcjami producenta.
Test proliferacji komórek HeLa przeprowadzono przy użyciu zestawu Cell Counting Kit 8 (Dojindo) zgodnie z instrukcjami producenta.
Wzrost E. coli DH5α analizowano poprzez pomiar gęstości komórek w hodowli przy użyciu spektrofotometru przy 600 nm (OD600).
Organizację cytoszkieletu w transgenicznych komórkach BY-2 obserwowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w konfokalne urządzenie skanujące CSU-X1 (Yokogawa) i kamerę sCMOS (Zyla, Andor Technology).Gęstość cytoszkieletu oceniano za pomocą analizy obrazu, która określała ilościowo odsetek pikseli cytoszkieletu wśród pikseli cytoplazmatycznych na obrazach konfokalnych przy użyciu oprogramowania ImageJ, jak opisano38,39.
Aby wykryć śmierć komórek w komórkach BY-2, porcję zawiesiny komórek inkubowano z 0,05% błękitem Evansa przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Selektywne barwienie martwych komórek błękitem Evansa polega na wytłaczaniu barwnika z żywych komórek przez nienaruszoną błonę komórkową40.Wybarwione komórki obserwowano przy użyciu mikroskopu z jasnym polem (BX53, Olympus).
Komórki HeLa hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.Komórki traktowano 100 µM KAND 11, kwasem kumamonamowym 6, kumamonamidem 1, 100 ng/ml kolcemidu (Gibco) lub 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) przez 6 godzin w 37°C.Komórki utrwalono MetOH przez 10 minut, a następnie octanem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.Utrwalone komórki inkubowano z pierwotnym przeciwciałem przeciwko β-tubulinie (1D4A4, Proteintech: 66240-1) rozcieńczonym w 0,5% BSA/PBS przez 2 godziny, przemyto 3 razy TBST, a następnie inkubowano z kozim przeciwciałem Alexa Fluor.488 1 godzina.– Mysie IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) i 15 ng/ml 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) rozcieńczony w 0,5% BSA/PBS.Po trzykrotnym przemyciu TBST wybarwione komórki obserwowano pod odwróconym mikroskopem Nikon Eclipse Ti-E.Obrazy wykonano chłodzoną kamerą CCD Hamamatsu ORCA-R2 przy użyciu oprogramowania MetaMorph (Molecular Devices).
Czas publikacji: 17 czerwca 2024 r