Choroby przenoszone przez komary nadal stanowią poważny problem zdrowia publicznego na świecieRosnąca odporność wektorów chorób, takich jak Culex pipiens pallens, na tradycyjne insektycydy dodatkowo pogłębia ten problem. W niniejszym badaniu zaprojektowano, zsyntetyzowano i oceniono szereg nowych hybryd tiofenowo-izochinolinonowych jako potencjalne larwicydy. Spośród zsyntetyzowanych związków, pochodne 5f, 6 i 7 wykazały znaczącą aktywność larwobójczą wobec larw Culex pipiens pallens, przy wartościach LC₅₀ odpowiednio 0,3, 0,1 i 1,85 μg/ml. Co godne uwagi, wszystkie dwanaście pochodnych tiofenowo-izochinolinonowych wykazało istotnie wyższą toksyczność niż referencyjny insektycyd organofosforanowy chloropiryfos (LC₅₀ = 293,8 μg/ml), co potwierdza wyższą toksyczność tych związków. Co ciekawe, syntetyczny produkt pośredni 1a (półester tiofenu) wykazał najwyższą aktywność (LC₅₀ = 0,004 μg/ml) i, choć nie został jeszcze w pełni zoptymalizowany, jego aktywność nadal przewyższała aktywność wszystkich finalnych pochodnych. Mechanistyczne badania biologiczne ujawniły silne objawy neurotoksyczności, sugerujące upośledzenie funkcji cholinergicznej. Symulacje dokowania molekularnego i dynamiki molekularnej potwierdziły tę obserwację, ujawniając silne specyficzne interakcje z acetylocholinoesterazą (AChE) i nikotynowym receptorem acetylocholiny (nAChR), co sugeruje możliwy mechanizm podwójnego działania. Obliczenia z wykorzystaniem teorii funkcjonału gęstości (DFT) dodatkowo potwierdziły korzystne właściwości elektronowe i reaktywność związków aktywnych. Różnorodność strukturalna i niezmiennie wysoka aktywność tej serii związków mogą zmniejszyć ryzyko oporności krzyżowej i ułatwić strategie zarządzania opornością poprzez rotację lub kombinację związków. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują, że hybrydy tiofenu i izochinolinonu stanowią obiecującą opcję w zakresie opracowywania larwicydów nowej generacji, oddziałujących na ścieżki neurofizjologiczne owadów przenoszących choroby.
Komary należą do najskuteczniejszych wektorów chorób zakaźnych, rozprzestrzeniając szeroką gamę niebezpiecznych patogenów i stanowiąc poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego na świecie. Gatunki takie jak Culex pipiens, Aedes aegypti i Anopheles gambiae są szczególnie znane z przenoszenia wirusów, bakterii i pasożytów, powodując miliony zakażeń i liczne zgony rocznie. Na przykład Culex pipiens jest głównym wektorem arbowirusów, takich jak wirus Zachodniego Nilu i wirus zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego St. Louis, a także chorób pasożytniczych, takich jak malaria ptasia. Najnowsze badania wykazały również, że Culex pipiens odgrywa znaczącą rolę w przenoszeniu i transmisji szkodliwych bakterii, takich jak Bacillus cereus i Staphylococcus warwickii, które zanieczyszczają żywność i zaostrzają problemy zdrowia publicznego. Wysoka zdolność adaptacji, przeżywalność i odporność komarów na metody zwalczania sprawiają, że są one trudne do zwalczania i stanowią stałe zagrożenie.
Chemiczne insektycydy są kluczowym narzędziem w zwalczaniu komarów, szczególnie podczas epidemii chorób przenoszonych przez komary. Różne klasy insektycydów, w tym pyretroidy, związki fosforoorganiczne i karbaminiany, są powszechnie stosowane w celu zmniejszenia populacji komarów i ograniczenia przenoszenia chorób. Jednak powszechne i długotrwałe stosowanie tych chemikaliów doprowadziło do poważnych problemów środowiskowych i zdrowotnych, w tym zaburzeń ekosystemów, szkodliwego wpływu na gatunki niebędące przedmiotem zwalczania oraz szybkiego rozwoju oporności na insektycydy w populacjach komarów.11,12,13,14Oporność ta znacząco obniża skuteczność wielu tradycyjnych insektycydów, co podkreśla pilną potrzebę opracowania innowacyjnych rozwiązań chemicznych o nowych mechanizmach działania, które pozwoliłyby skutecznie przeciwdziałać tym zmieniającym się zagrożeniom.11,12,13,14Aby sprostać tym poważnym wyzwaniom, naukowcy sięgają po alternatywne strategie, takie jak biokontrola, inżynieria genetyczna i zintegrowane zarządzanie wektorami (IVM). Podejścia te dają obiecujące rezultaty w zakresie zrównoważonej, długoterminowej kontroli komarów. Jednak w przypadku epidemii i sytuacji kryzysowych, metody chemiczne pozostają kluczowe dla szybkiego reagowania.
Alkaloidy izochinolinowe to ważne heterocykliczne związki zawierające azot, szeroko rozpowszechnione w królestwie roślin, obejmujące rodziny takie jak Amaryllidaceae, Rubiaceae, Magnoliaceae, Papaveraceae, Berberidaceae i Menispermaceae.30 Wcześniejsze badania potwierdziły, że alkaloidy izochinolinowe posiadają różnorodne właściwości biologiczne i cechy strukturalne, w tym działanie owadobójcze, przeciwcukrzycowe, przeciwnowotworowe, przeciwgrzybicze, przeciwzapalne, przeciwbakteryjne, przeciwpasożytnicze, antyoksydacyjne, przeciwwirusowe i neuroprotekcyjne.
W niniejszym badaniu wartości χ² dla wszystkich związków były poniżej progu krytycznego, a wartości p przekraczały 0,05. Wyniki te potwierdzają wiarygodność oszacowań LC₅₀ i dowodzą, że regresja probabilistyczna może skutecznie opisywać obserwowaną zależność dawka-odpowiedź. Dlatego wartości LC₅₀ i wskaźniki toksyczności (TI) obliczone na podstawie najbardziej aktywnego związku (1a) są wysoce wiarygodne i nadają się do porównywania efektów toksykologicznych.
Aby ocenić interakcje 12 nowo zsyntetyzowanych pochodnych tiofenu izochinolinonu oraz ich prekursora 1a z dwoma kluczowymi celami neuronalnymi komarów – acetylocholinoesterazą (AChE) i nikotynowym receptorem acetylocholiny (nAChR) – przeprowadziliśmy modelowanie dokowania molekularnego. Cele te wybrano na podstawie objawów neurotoksycznych obserwowanych w testach obumierania larw, wskazujących na upośledzenie sygnalizacji neuronalnej. Co więcej, strukturalne podobieństwo tych związków do organofosforanów i neonikotynoidów dodatkowo przemawia za preferowanym wyborem tych celów, ponieważ organofosforany i neonikotynoidy wywierają swoje działanie toksyczne poprzez hamowanie AChE i aktywację nAChR.
Co więcej, kilka związków (w tym 1a, 2, 5a, 5b, 5e, 5f i 7) oddziałuje z SER280. Reszty SER280 biorą udział w kształtowaniu konformacji struktury krystalicznej i są konserwowane w redopowanej konformacji BT7. Ta różnorodność sposobów interakcji podkreśla zdolność tych związków do adaptacji w miejscu aktywnym, przy czym SER280 i GLU359 potencjalnie służą jako adaptacyjne miejsca kotwiczenia w warunkach dokowania. Częste interakcje obserwowane między syntetycznymi pochodnymi a kluczowymi resztami, takimi jak GLU359 i SER280, które są składnikami znanej triady katalitycznej SER-HIS-GLU w ludzkiej acetylocholinoesterazie (AChE), dodatkowo potwierdzają hipotezę, że związki te mogą wywierać silne działanie hamujące na AChE poprzez wiązanie się z miejscami o znaczeniu katalitycznym.29,61,64
Co godne uwagi, związek 6 i jego prekursor 1a wykazały najsilniejszą aktywność przeciwko larwom w biopróbie, wykazując najniższe wartości LC₅₀ spośród związków w serii. Na poziomie molekularnym związek 6 wykazuje krytyczną interakcję z chloropiryfosem w miejscu GLU359, podczas gdy związek 1a nakłada się z ponownie domieszkowanym BT7 poprzez wiązanie wodorowe z SER280. Zarówno GLU359, jak i SER280 występują w oryginalnej krystalograficznej konformacji wiązania BT7 i są składnikami konserwatywnego tripletu katalitycznego acetylocholinoesterazy (SER–HIS–GLU), co podkreśla funkcjonalne znaczenie tych interakcji dla utrzymania aktywności hamującej związków (ryc. 10).
Zaobserwowane podobieństwo miejsc wiązania między pochodnymi BT7 (w tym natywnym i rekonstytuowanym BT7) a chloropiryfosem, szczególnie w resztach kluczowych dla aktywności katalitycznej, silnie sugeruje wspólny mechanizm hamowania tych związków. Podsumowując, wyniki te potwierdzają znaczący potencjał pochodnych tiofenu i izochinolinonu jako wysoce skutecznych inhibitorów acetylocholinoesterazy ze względu na ich konserwatywne i biologicznie istotne interakcje.
Silna korelacja między wynikami dokowania molekularnego a wynikami biotestu larwalnego dodatkowo potwierdza, że acetylocholinoesteraza (AChE) i nikotynowy receptor acetylocholiny (nAChR) są głównymi neurotoksycznymi celami syntetyzowanych pochodnych tiofenu i izochinolinonu. Chociaż wyniki dokowania dostarczają istotnych informacji na temat powinowactwa receptor-ligand, należy pamiętać, że sama energia wiązania nie jest wystarczająca, aby w pełni wyjaśnić skuteczność insektycydową in vivo. Różnice w wartościach LC₅₀ między związkami o podobnych właściwościach dokowania mogą wynikać z takich czynników, jak stabilność metaboliczna, wchłanianie, biodostępność i dystrybucja w organizmach owadów.⁶⁰,⁶⁴Jednakże racjonalna struktura projektu, wysokie powinowactwo receptora symulowane za pomocą symulacji komputerowej i silna aktywność biologiczna zdecydowanie potwierdzają pogląd, że AChE i nAChR są głównymi mediatorami obserwowanej neurotoksyczności.
Podsumowując, zsyntetyzowane hybrydy tiofenu i izochinolinonu posiadają kluczowe elementy strukturalne i funkcjonalne, w dużej mierze kompatybilne ze znanymi neuroaktywnymi insektycydami. Ich zdolność do efektywnego wiązania się z acetylocholinoesterazą (AChE) i receptorami nikotynowymi acetylocholiny (nAChR) poprzez komplementarne mechanizmy interakcji podkreśla ich potencjał jako insektycydów o podwójnym celu działania. Ten podwójny mechanizm nie tylko zwiększa skuteczność owadobójczą, ale także stanowi obiecującą strategię pokonywania istniejących mechanizmów oporności, co czyni te związki obiecującymi kandydatami do opracowania środków zwalczania komarów nowej generacji.
Symulacje dynamiki molekularnej (MD) służą do walidacji i rozszerzania wyników dokowania molekularnego, zapewniając bardziej realistyczną i zależną od czasu ocenę interakcji ligand-cel w realistycznych warunkach fizjologicznych. Chociaż dokowanie molekularne może dostarczyć cennych wstępnych informacji na temat potencjalnych pozycji wiązania i powinowactw, jest to model statyczny i nie uwzględnia elastyczności receptora, dynamiki rozpuszczalnika ani fluktuacji czasowych w interakcjach molekularnych. Dlatego symulacje MD stanowią ważną, uzupełniającą metodę oceny stabilności kompleksów, odporności interakcji oraz zmian konformacyjnych ligandów i białek w czasie.60,62,71
Ze względu na ich lepsze właściwości wiązania z acetylocholinoesterazą (AChE) w porównaniu z nikotynowym receptorem acetylocholiny (nAChR), wybraliśmy cząsteczkę macierzystą 1a (o najniższej wartości LC₅₀) oraz najbardziej aktywny związek tiofenowo-izochinolinowy 6 do symulacji dynamiki molekularnej (MD). Celem było sprawdzenie, czy ich konformacja wiązania w miejscu aktywnym AChE pozostała stabilna w ciągu 100 ns symulacji oraz porównanie ich zachowania wiązania z chloropiryfosem i inhibitorem AChE BT7, który powstał w wyniku kokrystalizacji odbicia.
Symulacje dynamiki molekularnej obejmowały odchylenie średniokwadratowe (RMSD) w celu oceny ogólnej stabilności kompleksu; odchylenie średniokwadratowe fluktuacji (RMSF) w celu zbadania elastyczności reszt; oraz analizę interakcji ligand-akceptor w celu określenia stabilności wiązań wodorowych, kontaktów hydrofobowych i oddziaływań jonowych (dane uzupełniające). Chociaż wartości RMSD i RMSF dla wszystkich ligandów utrzymywały się w stabilnym zakresie, wskazując na brak istotnych zmian konformacyjnych w kompleksie AChE-ligand (rysunek 12), same te parametry nie są wystarczające, aby w pełni wyjaśnić różnice w masie wiązania między związkami.
Czas publikacji: 15 grudnia 2025 r.