Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić stałe wsparcie, wyświetlamy witrynę bez stylów ani JavaScript.
Kombinacje związków owadobójczych pochodzenia roślinnego mogą wykazywać synergistyczne lub antagonistyczne interakcje przeciwko szkodnikom. Biorąc pod uwagę szybkie rozprzestrzenianie się chorób przenoszonych przez komary Aedes i rosnącą odporność populacji komarów Aedes na tradycyjne insektycydy, opracowano dwadzieścia osiem kombinacji związków terpenowych na bazie olejków eterycznych roślinnych i przetestowano je na larwach i dorosłych stadiach Aedes aegypti. Początkowo oceniono pięć olejków eterycznych roślinnych (EO) pod kątem ich skuteczności larwicydowej i stosowania u osobników dorosłych, a w każdym EO zidentyfikowano dwa główne związki na podstawie wyników GC-MS. Zakupiono główne zidentyfikowane związki, a mianowicie disiarczek diallilu, trisiarczek diallilu, karwon, limonen, eugenol, metyloeugenol, eukaliptol, eudesmol i alfa-pinen komarów. Następnie przygotowano binarne kombinacje tych związków przy użyciu dawek subletalnych, a ich synergistyczne i antagonistyczne efekty przetestowano i określono. Najlepsze kompozycje larwicydalne uzyskuje się przez zmieszanie limonenu z disiarczkiem diallilu, a najlepsze kompozycje adulticydalne uzyskuje się przez zmieszanie karwonu z limonenem. Komercyjnie stosowany syntetyczny larwicyd Temphos i lek dla dorosłych Malathion testowano oddzielnie i w kombinacjach binarnych z terpenoidami. Wyniki wykazały, że połączenie temefosu i disiarczku diallilu oraz malationu i eudesmolu było najskuteczniejszą kombinacją. Te silne kombinacje mają potencjał do zastosowania przeciwko Aedes aegypti.
Olejki eteryczne roślinne (EO) to metabolity wtórne zawierające różne związki bioaktywne i stają się coraz ważniejsze jako alternatywa dla syntetycznych pestycydów. Są nie tylko przyjazne dla środowiska i użytkownika, ale stanowią również mieszaninę różnych związków bioaktywnych, co również zmniejsza prawdopodobieństwo rozwoju lekooporności1. Wykorzystując technologię GC-MS, naukowcy zbadali składniki różnych olejków eterycznych roślinnych i zidentyfikowali ponad 3000 związków z 17 500 roślin aromatycznych2, z których większość została przetestowana pod kątem właściwości owadobójczych i stwierdzono, że mają one działanie owadobójcze3,4. Niektóre badania podkreślają, że toksyczność głównego składnika związku jest taka sama lub większa niż toksyczność jego surowego tlenku etylenu. Jednak stosowanie pojedynczych związków może ponownie pozostawić pole do rozwoju oporności, jak ma to miejsce w przypadku chemicznych insektycydów5,6. Dlatego obecnie skupiamy się na przygotowywaniu mieszanek związków na bazie tlenku etylenu w celu poprawy skuteczności insektycydów i zmniejszenia prawdopodobieństwa oporności w docelowych populacjach szkodników. Poszczególne związki aktywne obecne w olejkach eterycznych mogą wykazywać synergistyczne lub antagonistyczne działanie w kombinacjach odzwierciedlających ogólną aktywność olejku eterycznego, co zostało dobrze podkreślone w badaniach przeprowadzonych przez poprzednich badaczy7,8. Program kontroli wektorów obejmuje również olejki eteryczne i ich składniki. Działanie komarobójcze olejków eterycznych zostało szeroko zbadane na komarach Culex i Anopheles. W kilku badaniach próbowano opracować skuteczne pestycydy poprzez łączenie różnych roślin z komercyjnie stosowanymi syntetycznymi pestycydami w celu zwiększenia ogólnej toksyczności i zminimalizowania skutków ubocznych9. Jednak badania takich związków przeciwko Aedes aegypti pozostają rzadkie. Postęp w nauce medycznej oraz rozwój leków i szczepionek pomogły zwalczać niektóre choroby przenoszone przez wektory. Jednak obecność różnych serotypów wirusa przenoszonego przez komara Aedes aegypti doprowadziła do niepowodzenia programów szczepień. Dlatego też, gdy występują takie choroby, programy kontroli wektorów są jedyną opcją zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby. W obecnej sytuacji kontrola Aedes aegypti jest bardzo ważna, ponieważ jest kluczowym wektorem różnych wirusów i ich serotypów powodujących gorączkę denga, Zika, gorączkę krwotoczną denga, żółtą febrę itp. Najbardziej godnym uwagi jest fakt, że liczba przypadków prawie wszystkich chorób przenoszonych przez wektory Aedes rośnie każdego roku w Egipcie i rośnie na całym świecie. Dlatego w tym kontekście istnieje pilna potrzeba opracowania przyjaznych dla środowiska i skutecznych środków kontroli populacji Aedes aegypti. Potencjalnymi kandydatami w tym zakresie są olejki eteryczne, ich związki składowe i ich kombinacje. Dlatego w tym badaniu podjęto próbę zidentyfikowania skutecznych synergistycznych kombinacji kluczowych związków olejków eterycznych z pięciu roślin o właściwościach owadobójczych (tj. mięta, bazylia święta, eukaliptus plamisty, Allium sulfur i melaleuca) przeciwko Aedes aegypti.
Wszystkie wybrane olejki eteryczne wykazały potencjalną aktywność larwobójczą wobec Aedes aegypti, przy czym 24-godzinna wartość LC50 mieściła się w zakresie od 0,42 do 163,65 ppm. Najwyższą aktywność larwobójczą odnotowano dla olejku eterycznego z mięty pieprzowej (Mp) o wartości LC50 wynoszącej 0,42 ppm po 24 godzinach, a następnie dla czosnku (As) o wartości LC50 wynoszącej 16,19 ppm po 24 godzinach (Tabela 1).
Z wyjątkiem Ocimum Sainttum, Os EO, wszystkie cztery inne przebadane EO wykazały oczywiste działanie alergizujące, przy czym wartości LC50 wahały się od 23,37 do 120,16 ppm w okresie 24-godzinnej ekspozycji. Thymophilus striata (Cl) EO był najskuteczniejszy w zabijaniu dorosłych osobników z wartością LC50 wynoszącą 23,37 ppm w ciągu 24 godzin od ekspozycji, a następnie Eucalyptus maculata (Em), który miał wartość LC50 wynoszącą 101,91 ppm (Tabela 1). Z drugiej strony, wartość LC50 dla Os nie została jeszcze ustalona, ponieważ najwyższy wskaźnik śmiertelności wynoszący 53% odnotowano przy najwyższej dawce (Rysunek uzupełniający 3).
Dwa główne związki składowe w każdym EO zostały zidentyfikowane i wybrane na podstawie wyników bazy danych biblioteki NIST, procentowej powierzchni chromatogramu GC i wyników widm MS (Tabela 2). W przypadku EO As głównymi zidentyfikowanymi związkami były disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu; w przypadku EO Mp głównymi zidentyfikowanymi związkami były karwon i limonen, w przypadku EO Em głównymi zidentyfikowanymi związkami były eudesmol i eukaliptol; w przypadku EO Os głównymi zidentyfikowanymi związkami były eugenol i metyloeugenol, a w przypadku EO Cl głównymi zidentyfikowanymi związkami były eugenol i α-pinen (Rysunek 1, Rysunki uzupełniające 5–8, Tabela uzupełniająca 1–5).
Wyniki spektrometrii masowej głównych terpenoidów wybranych olejków eterycznych (A-diallilowy disulfid; B-diallilowy trisulfid; C-eugenol; D-metyloeugenol; E-limonen; F-aromatyczny ceperon; G-α-pinen; H-cyneol; R-eudamol).
Łącznie dziewięć związków (disiarczek diallilu, trisiarczek diallilu, eugenol, metyloeugenol, karwon, limonen, eukaliptol, eudesmol, α-pinen) zidentyfikowano jako skuteczne związki, które są głównymi składnikami olejku eterycznego i indywidualnie poddano je bioanalizie przeciwko Aedes aegypti w stadiach larwalnych. Związek eudesmol miał najwyższą aktywność larwobójczą z wartością LC50 wynoszącą 2,25 ppm po 24 godzinach ekspozycji. Stwierdzono również, że związki disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu mają potencjalne działanie larwobójcze, przy średnich dawkach subletalnych w zakresie 10–20 ppm. Umiarkowaną aktywność larwobójczą ponownie zaobserwowano dla związków eugenolu, limonenu i eukaliptolu z wartościami LC50 wynoszącymi odpowiednio 63,35 ppm, 139,29 ppm i 181,33 ppm po 24 godzinach (Tabela 3). Jednak nie stwierdzono znaczącego potencjału larwobójczego metyloeugenolu i karwonu nawet przy najwyższych dawkach, więc wartości LC50 nie zostały obliczone (Tabela 3). Syntetyczny larwicyd Temephos miał średnie stężenie śmiertelne wynoszące 0,43 ppm dla Aedes aegypti w ciągu 24 godzin narażenia (Tabela 3, Tabela uzupełniająca 6).
Siedem związków (disiarczek diallilu, trisiarczek diallilu, eukaliptol, α-pinen, eudesmol, limonen i karwon) zidentyfikowano jako główne związki skutecznego olejku eterycznego i przetestowano je indywidualnie na dorosłych komarach egipskich Aedes. Zgodnie z analizą regresji Probit stwierdzono, że Eudesmol ma najwyższy potencjał z wartością LC50 wynoszącą 1,82 ppm, a następnie Eukaliptol z wartością LC50 wynoszącą 17,60 ppm przy 24-godzinnym czasie ekspozycji. Pozostałe pięć przetestowanych związków było umiarkowanie szkodliwych dla dorosłych z wartościami LC50 wynoszącymi od 140,79 do 737,01 ppm (Tabela 3). Syntetyczny malation fosforoorganiczny okazał się mniej skuteczny niż eudesmol, ale silniejszy niż sześć pozostałych związków, przy czym wartość LC50 wyniosła 5,44 ppm w okresie 24-godzinnej ekspozycji (Tabela 3, Tabela uzupełniająca 6).
Siedem silnych związków ołowiu i organofosforowy tamefosat wybrano do sformułowania binarnych kombinacji ich dawek LC50 w stosunku 1:1. W sumie przygotowano 28 binarnych kombinacji i przetestowano ich skuteczność larwobójczą przeciwko Aedes aegypti. Dziewięć kombinacji okazało się synergistycznych, 14 antagonistycznych, a pięć nie było larwobójczych. Spośród synergistycznych kombinacji, kombinacja disiarczku diallilu i temofolu była najskuteczniejsza, ze 100% śmiertelnością zaobserwowaną po 24 godzinach (Tabela 4). Podobnie, mieszaniny limonenu z disiarczkiem diallilu i eugenolu z tymefosem wykazały dobry potencjał ze obserwowaną śmiertelnością larw na poziomie 98,3% (Tabela 5). Pozostałe 4 kombinacje, mianowicie eudesmol plus eukaliptol, eudesmol plus limonen, eukaliptol plus alfa-pinen, alfa-pinen plus temefos, również wykazały znaczną skuteczność larwobójczą, przy czym zaobserwowane wskaźniki śmiertelności przekraczały 90%. Oczekiwany wskaźnik śmiertelności wynosi około 60-75%. (Tabela 4). Jednak połączenie limonenu z α-pinenem lub eukaliptusem wykazało reakcje antagonistyczne. Podobnie stwierdzono, że mieszanki temefosu z eugenolem lub eukaliptusem lub eudesmolem lub trisulfidem diallilu mają działanie antagonistyczne. Podobnie połączenie disulfidu diallilu i trisulfidu diallilu oraz połączenie któregokolwiek z tych związków z eudesmolem lub eugenolem są antagonistyczne w swoim działaniu larwobójczym. Antagonizm odnotowano również w przypadku połączenia eudesmolu z eugenolem lub α-pinenem.
Ze wszystkich 28 mieszanek binarnych testowanych pod kątem aktywności kwasowej u dorosłych, 7 kombinacji było synergistycznych, 6 nie miało żadnego efektu, a 15 było antagonistycznych. Mieszanki eudesmolu z eukaliptusem i limonenu z karwonem okazały się skuteczniejsze niż inne synergistyczne kombinacje, ze wskaźnikami śmiertelności po 24 godzinach wynoszącymi odpowiednio 76% i 100% (Tabela 5). Zaobserwowano, że malation wykazuje efekt synergistyczny ze wszystkimi kombinacjami związków z wyjątkiem limonenu i trisulfidu diallilu. Z drugiej strony stwierdzono antagonizm między disulfidem diallilu i trisulfidem diallilu oraz kombinacją któregokolwiek z nich z eukaliptusem, eukaliptolem, karwonem lub limonenem. Podobnie, połączenia α-pinenu z eudesmolem lub limonenem, eukaliptolu z karwonem lub limonenem oraz limonenu z eudesmolem lub malationem wykazały antagonistyczne działanie larwicydalne. W przypadku pozostałych sześciu połączeń nie było istotnej różnicy między oczekiwaną a obserwowaną śmiertelnością (Tabela 5).
Na podstawie efektów synergistycznych i dawek subletalnych ostatecznie wybrano i dalej testowano ich toksyczność larwobójczą wobec dużej liczby komarów Aedes aegypti. Wyniki wykazały, że obserwowana śmiertelność larw przy użyciu kombinacji binarnych eugenol-limonen, diallilowy disiarczek-limonen i diallilowy disiarczek-timephos wynosiła 100%, podczas gdy oczekiwana śmiertelność larw wynosiła odpowiednio 76,48%, 72,16% i 63,4% (Tabela 6). . Połączenie limonenu i eudesmolu było stosunkowo mniej skuteczne, przy czym zaobserwowano 88% śmiertelność larw w ciągu 24-godzinnego okresu ekspozycji (Tabela 6). Podsumowując, cztery wybrane kombinacje binarne wykazały również synergistyczne efekty larwobójcze wobec Aedes aegypti po zastosowaniu na dużą skalę (Tabela 6).
Wybrano trzy synergistyczne kombinacje do biotestu adultobójczego w celu kontrolowania dużych populacji dorosłych osobników Aedes aegypti. Aby wybrać kombinacje do przetestowania na dużych koloniach owadów, najpierw skupiliśmy się na dwóch najlepszych synergistycznych kombinacjach terpenów, a mianowicie karwon plus limonen i eukaliptol plus eudesmol. Po drugie, najlepszą synergistyczną kombinację wybrano z kombinacji syntetycznego organofosforanowego malationu i terpenoidów. Uważamy, że kombinacja malationu i eudesmolu jest najlepszą kombinacją do testowania na dużych koloniach owadów ze względu na najwyższą obserwowaną śmiertelność i bardzo niskie wartości LC50 składników kandydackich. Malation wykazuje synergizm w połączeniu z α-pinenem, disiarczkiem diallilu, eukaliptusem, karwonem i eudesmolem. Ale jeśli spojrzymy na wartości LC50, Eudesmol ma najniższą wartość (2,25 ppm). Obliczone wartości LC50 malationu, α-pinenu, disiarczku diallilu, eukaliptolu i karwonu wynosiły odpowiednio 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 i 140,79 ppm. Wartości te wskazują, że połączenie malationu i eudesmolu jest optymalnym połączeniem pod względem dawkowania. Wyniki wykazały, że połączenia karwonu plus limonenu i eudesmolu plus malationu miały 100% obserwowanej śmiertelności w porównaniu z oczekiwaną śmiertelnością wynoszącą 61% do 65%. Inna kombinacja, eudesmol plus eukaliptol, wykazała współczynnik śmiertelności wynoszący 78,66% po 24 godzinach narażenia, w porównaniu z oczekiwanym współczynnikiem śmiertelności wynoszącym 60%. Wszystkie trzy wybrane połączenia wykazały efekty synergistyczne nawet przy zastosowaniu na dużą skalę przeciwko dorosłym Aedes aegypti (Tabela 6).
W tym badaniu wybrane olejki eteryczne roślinne, takie jak Mp, As, Os, Em i Cl, wykazały obiecujące efekty śmiertelne na larwy i dorosłe stadia Aedes aegypti. Olejek eteryczny Mp miał najwyższą aktywność larwobójczą z wartością LC50 wynoszącą 0,42 ppm, a następnie olejki eteryczne As, Os i Em z wartością LC50 mniejszą niż 50 ppm po 24 godzinach. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami komarów i innych muchówek10,11,12,13,14. Chociaż potencjał larwobójczy Cl jest niższy niż innych olejków eterycznych, z wartością LC50 wynoszącą 163,65 ppm po 24 godzinach, jego potencjał dla dorosłych jest najwyższy z wartością LC50 wynoszącą 23,37 ppm po 24 godzinach. Olejki eteryczne Mp, As i Em wykazały również dobry potencjał alergobójczy z wartościami LC50 w zakresie 100–120 ppm po 24 godzinach ekspozycji, ale były stosunkowo niższe od ich skuteczności larwobójczej. Z drugiej strony olejki eteryczne Os wykazały nieistotny efekt alergobójczy nawet przy najwyższej dawce terapeutycznej. Tak więc wyniki wskazują, że toksyczność tlenku etylenu dla roślin może się różnić w zależności od etapu rozwojowego komarów15. Zależy ona również od szybkości penetracji olejków eterycznych do organizmu owada, ich interakcji ze specyficznymi enzymami docelowymi i zdolności detoksykacyjnej komara na każdym etapie rozwojowym16. Duża liczba badań wykazała, że główny związek składowy jest ważnym czynnikiem w biologicznej aktywności tlenku etylenu, ponieważ stanowi większość całkowitych związków3,12,17,18. Dlatego też rozważyliśmy dwa główne związki w każdym olejku eterycznym. Na podstawie wyników GC-MS, disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu zostały zidentyfikowane jako główne związki EO As, co jest zgodne z poprzednimi raportami19,20,21. Chociaż poprzednie raporty wskazywały, że mentol był jednym z jego głównych związków, karwon i limonen zostały ponownie zidentyfikowane jako główne związki Mp EO22,23. Profil składu Os EO wykazał, że eugenol i metyloeugenol są głównymi związkami, co jest podobne do ustaleń wcześniejszych badaczy16,24. Eukaliptol i eukaliptol zostały zgłoszone jako główne związki obecne w olejku z liści Em, co jest zgodne z ustaleniami niektórych badaczy25,26, ale sprzeczne z ustaleniami Olalade i in.27. Dominację cyneolu i α-pinenu zaobserwowano w olejku eterycznym z melaleuca, co jest podobne do ustaleń wcześniejszych badań28,29. Zgłoszono wewnątrzgatunkowe różnice w składzie i stężeniu olejków eterycznych ekstrahowanych z tych samych gatunków roślin w różnych lokalizacjach, które również zaobserwowano w tym badaniu, na które wpływają geograficzne warunki wzrostu roślin, czas zbioru, stadium rozwojowe lub wiek rośliny. pojawienie się chemotypów itp.22,30,31,32. Następnie zakupiono kluczowe zidentyfikowane związki i przetestowano je pod kątem ich działania larwobójczego i wpływu na dorosłe komary Aedes aegypti. Wyniki wykazały, że aktywność larwobójcza disiarczku diallilu była porównywalna z aktywnością surowego EO As. Jednak aktywność trisiarczku diallilu jest wyższa niż EO As. Wyniki te są podobne do wyników uzyskanych przez Kimbaris i in. 33 na temat Culex philippines. Jednak te dwa związki nie wykazały dobrej aktywności autobójczej wobec docelowych komarów, co jest zgodne z wynikami Plata-Rueda i in. 34 na temat Tenebrio molitor. Os EO jest skuteczny przeciwko stadium larwalnemu Aedes aegypti, ale nie przeciwko stadium dorosłemu. Ustalono, że aktywność larwobójcza głównych pojedynczych związków jest niższa niż surowego Os EO. Sugeruje to rolę innych związków i ich interakcji w surowym tlenku etylenu. Sam metyloeugenol ma znikomą aktywność, podczas gdy sam eugenol ma umiarkowaną aktywność larwobójczą. Wniosek ten potwierdza, z jednej strony,35,36, a z drugiej, zaprzecza wnioskom wcześniejszych badaczy37,38. Różnice w grupach funkcyjnych eugenolu i metyloeugenolu mogą skutkować różną toksycznością dla tego samego owada docelowego39. Stwierdzono, że limonen ma umiarkowaną aktywność larwobójczą, podczas gdy wpływ karwonu był nieistotny. Podobnie, stosunkowo niska toksyczność limonenu dla owadów dorosłych i wysoka toksyczność karwonu potwierdzają wyniki niektórych wcześniejszych badań40, ale przeczą innym41. Obecność podwójnych wiązań zarówno w pozycjach wewnątrzcyklicznych, jak i egzocyklicznych może zwiększyć korzyści płynące z tych związków jako larwicydów3,41, podczas gdy karwon, który jest ketonem z nienasyconymi atomami węgla alfa i beta, może wykazywać wyższy potencjał toksyczności u dorosłych42. Jednak indywidualne cechy limonenu i karwonu są znacznie niższe niż całkowita Mp EO (Tabela 1, Tabela 3). Spośród testowanych terpenoidów stwierdzono, że eudesmol ma największą aktywność larwicydalną i dorosłą z wartością LC50 poniżej 2,5 ppm, co czyni go obiecującym związkiem do zwalczania komarów Aedes. Jego wydajność jest lepsza niż całego EO Em, chociaż nie jest to zgodne z wynikami Cheng i in.40. Eudesmol jest seskwiterpenem z dwiema jednostkami izoprenowymi, który jest mniej lotny niż utlenione monoterpeny, takie jak eukaliptus, a zatem ma większy potencjał jako pestycyd. Eukaliptol sam w sobie ma większą aktywność dorosłych osobników niż larwobójczą, a wyniki wcześniejszych badań zarówno to potwierdzają, jak i obalają37,43,44. Sama aktywność jest niemal porównywalna z aktywnością całego EO Cl. Inny bicykliczny monoterpen, α-pinen, ma mniejszy wpływ na dorosłe osobniki Aedes aegypti niż działanie larwobójcze, co jest przeciwieństwem działania pełnego EO Cl. Całkowita aktywność owadobójcza terpenoidów jest zależna od ich lipofilowości, lotności, rozgałęzień węglowych, powierzchni projekcji, powierzchni, grup funkcyjnych i ich położenia45,46. Związki te mogą działać poprzez niszczenie akumulacji komórek, blokowanie aktywności oddechowej, przerywanie przekazywania impulsów nerwowych itp.47 Stwierdzono, że syntetyczny organofosforan Temephos ma najwyższą aktywność larwobójczą z wartością LC50 wynoszącą 0,43 ppm, co jest zgodne z danymi Leka -Utala48. Aktywność dorosłych osobników syntetycznego organofosforowego malationu odnotowano na poziomie 5,44 ppm. Chociaż te dwa organofosforany wykazały korzystne reakcje na laboratoryjne szczepy Aedes aegypti, w różnych częściach świata odnotowano oporność komarów na te związki49. Nie znaleziono jednak podobnych raportów o rozwoju oporności na leki ziołowe50. Dlatego też środki botaniczne są uważane za potencjalne alternatywy dla pestycydów chemicznych w programach kontroli wektorów.
Działanie larwobójcze przetestowano na 28 kombinacjach binarnych (1:1) przygotowanych z silnych terpenoidów i terpenoidów z tymetopsem, i stwierdzono, że 9 kombinacji działa synergicznie, 14 antagonistycznie, a 5 antagonistycznie. Brak efektu. Z drugiej strony, w biopróbie potencjału osobników dorosłych stwierdzono, że 7 kombinacji działa synergicznie, 15 antagonistycznie, a 6 kombinacji nie działa. Powodem, dla którego pewne kombinacje wywołują efekt synergiczny, może być jednoczesne oddziaływanie związków kandydackich na różne ważne szlaki lub sekwencyjne hamowanie różnych kluczowych enzymów określonego szlaku biologicznego51. Stwierdzono, że połączenie limonenu z disiarczkiem diallilu, eukaliptusem lub eugenolem działa synergicznie zarówno w zastosowaniach na małą, jak i dużą skalę (Tabela 6), podczas gdy jego połączenie z eukaliptusem lub α-pinenem miało antagonistyczne działanie na larwy. Średnio limonen wydaje się być dobrym synergistą, prawdopodobnie ze względu na obecność grup metylowych, dobrą penetrację do warstwy rogowej naskórka i inny mechanizm działania52,53. Wcześniej donoszono, że limonen może powodować toksyczne skutki poprzez penetrację kutykuli owadów (toksyczność kontaktowa), wpływając na układ trawienny (środek przeciwpokarmowy) lub wpływając na układ oddechowy (aktywność fumigacyjna),54 podczas gdy fenylopropanoidy, takie jak eugenol, mogą wpływać na enzymy metaboliczne55. Dlatego też połączenia związków o różnych mechanizmach działania mogą zwiększać ogólny śmiertelny efekt mieszanki. Stwierdzono, że eukaliptol działa synergicznie z disiarczkiem diallilu, eukaliptusem lub α-pinenem, ale inne połączenia z innymi związkami były albo nielarwicydalne, albo antagonistyczne. Wczesne badania wykazały, że eukaliptol ma działanie hamujące na acetylocholinoesterazę (AChE), a także na receptory oktaaminy i GABA56. Ponieważ cykliczne monoterpeny, eukaliptol, eugenol itp. mogą mieć ten sam mechanizm działania, co ich aktywność neurotoksyczna,57 minimalizując w ten sposób ich łączone efekty poprzez wzajemne hamowanie. Podobnie stwierdzono, że połączenie Temephos z disiarczkiem diallilu, α-pinenem i limonenem działa synergicznie, co potwierdza wcześniejsze doniesienia o synergistycznym efekcie między produktami ziołowymi a syntetycznymi organofosforanami58.
Stwierdzono, że połączenie eudesmolu i eukaliptolu ma synergistyczne działanie na larwy i dorosłe stadia Aedes aegypti, prawdopodobnie ze względu na ich różne tryby działania wynikające z ich różnych struktur chemicznych. Eudesmol (seskwiterpen) może wpływać na układ oddechowy 59, a eukaliptol (monoterpen) może wpływać na acetylocholinoesterazę 60. Jednoczesna ekspozycja składników na dwa lub więcej miejsc docelowych może zwiększyć ogólny efekt śmiertelny połączenia. W biotestach substancji dorosłych stwierdzono, że malation działa synergicznie z karwonem lub eukaliptolem lub eukaliptolem lub disiarczkiem diallilu lub α-pinenem, co wskazuje, że działa synergicznie z dodatkiem limonenu i di. Dobre synergistyczne kandydatki na alergeny dla całego portfolio związków terpenowych, z wyjątkiem trisiarczku allilu. Thangam i Kathiresan61 również zgłosili podobne wyniki synergistycznego działania malationu z ekstraktami ziołowymi. Ta synergistyczna odpowiedź może być spowodowana łącznym toksycznym działaniem malationu i fitozwiązków na enzymy detoksykujące owadów. Organofosforany, takie jak malation, działają na ogół poprzez hamowanie esteraz cytochromu P450 i monooksygenaz62,63,64. Dlatego połączenie malationu z tymi mechanizmami działania i terpenów z różnymi mechanizmami działania może zwiększyć ogólny efekt śmiertelny dla komarów.
Z drugiej strony antagonizm wskazuje, że wybrane związki są mniej aktywne w połączeniu niż każdy związek osobno. Powodem antagonizmu w niektórych połączeniach może być to, że jeden związek modyfikuje zachowanie drugiego związku, zmieniając szybkość wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu lub wydalania. Wcześni badacze uważali to za przyczynę antagonizmu w połączeniach leków. Cząsteczki Możliwy mechanizm 65. Podobnie, możliwe przyczyny antagonizmu mogą być związane z podobnymi mechanizmami działania, konkurencją związków składowych o ten sam receptor lub miejsce docelowe. W niektórych przypadkach może również wystąpić niekonkurencyjne hamowanie białka docelowego. W tym badaniu dwa związki siarki organicznej, disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu, wykazały antagonistyczne działanie, prawdopodobnie z powodu konkurencji o to samo miejsce docelowe. Podobnie, te dwa związki siarki wykazały antagonistyczne działanie i nie miały żadnego działania w połączeniu z eudesmolem i α-pinenem. Eudesmol i alfa-pinen mają charakter cykliczny, podczas gdy disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu mają charakter alifatyczny. Na podstawie struktury chemicznej połączenie tych związków powinno zwiększyć ogólną aktywność letalną, ponieważ ich miejsca docelowe są zwykle różne34,47, ale eksperymentalnie stwierdziliśmy antagonizm, który może wynikać z roli tych związków w niektórych nieznanych organizmach in vivo. układach w wyniku interakcji. Podobnie połączenie cyneolu i α-pinenu wywołało antagonistyczne odpowiedzi, chociaż badacze wcześniej zgłosili, że oba związki mają różne cele działania47,60. Ponieważ oba związki są cyklicznymi monoterpenami, mogą istnieć pewne wspólne miejsca docelowe, które mogą konkurować o wiązanie i wpływać na ogólną toksyczność badanych par kombinatorycznych.
Na podstawie wartości LC50 i zaobserwowanej śmiertelności wybrano dwie najlepsze synergistyczne kombinacje terpenów, a mianowicie pary karwon + limonen i eukaliptol + eudesmol, a także syntetyczny organofosforowy malation z terpenami. Optymalną synergistyczną kombinację związków malation + eudesmol przetestowano w bioteście dorosłych insektycydów. Celuj w duże kolonie owadów, aby potwierdzić, czy te skuteczne kombinacje mogą działać przeciwko dużej liczbie osobników na stosunkowo dużych przestrzeniach ekspozycji. Wszystkie te kombinacje wykazują synergistyczny efekt przeciwko dużym rojom owadów. Podobne wyniki uzyskano dla optymalnej synergistycznej kombinacji larwicydalnej przetestowanej przeciwko dużym populacjom larw Aedes aegypti. Można zatem powiedzieć, że skuteczna synergistyczna kombinacja larwicydalna i adulticydalna związków roślinnych EO jest silnym kandydatem przeciwko istniejącym syntetycznym chemikaliom i może być dalej stosowana do zwalczania populacji Aedes aegypti. Podobnie, skuteczne kombinacje syntetycznych larwicydów lub adultycydów z terpenami mogą być również stosowane w celu zmniejszenia dawek tymetylu lub malationu podawanych komarom. Te silne synergistyczne kombinacje mogą zapewnić rozwiązania dla przyszłych badań nad ewolucją lekooporności u komarów Aedes.
Jaja komara Aedes aegypti zebrano z Regionalnego Centrum Badań Medycznych w Dibrugarh, Indian Council of Medical Research i przechowywano w kontrolowanej temperaturze (28 ± 1 °C) i wilgotności (85 ± 5%) w Katedrze Zoologii Uniwersytetu Gauhati w następujących warunkach: Arivoli opisali i in. Po wykluciu larwy karmiono pokarmem dla larw (proszek z herbatników dla psów i drożdże w stosunku 3:1), a dorosłe osobniki karmiono 10% roztworem glukozy. Począwszy od 3. dnia po wykluciu dorosłym samicom komarów pozwolono ssać krew białych szczurów. Namocz bibułę filtracyjną w wodzie w szklance i umieść ją w klatce do składania jaj.
Wybrane próbki roślin, a mianowicie liście eukaliptusa (Myrtaceae), bazylia święta (Lamiaceae), mięta (Lamiaceae), melaleuca (Myrtaceae) i cebule czosnku (Amaryllidaceae). Zebrane w Guwahati i zidentyfikowane przez Wydział Botaniki Uniwersytetu Gauhati. Zebrane próbki roślin (500 g) poddano hydrodestylacji przy użyciu aparatu Clevenger przez 6 godzin. Wyekstrahowany olejek eteryczny zebrano do czystych szklanych fiolek i przechowywano w temperaturze 4°C do dalszych badań.
Toksyczność larwobójczą badano stosując nieznacznie zmodyfikowane standardowe procedury Światowej Organizacji Zdrowia67. Jako emulgator stosowano DMSO. Każde stężenie EO początkowo testowano przy stężeniu 100 i 1000 ppm, wystawiając 20 larw w każdym powtórzeniu. Na podstawie wyników zastosowano zakres stężeń i rejestrowano śmiertelność od 1 godziny do 6 godzin (w odstępach 1-godzinnych) oraz po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach od zabiegu. Stężenia subletalne (LC50) określano po 24, 48 i 72 godzinach od narażenia. Każde stężenie badano trzykrotnie wraz z jedną kontrolą negatywną (tylko woda) i jedną kontrolą pozytywną (woda poddana działaniu DMSO). Jeśli wystąpi przepoczwarczenie i umrze więcej niż 10% larw z grupy kontrolnej, eksperyment powtarza się. Jeśli śmiertelność w grupie kontrolnej wynosi od 5 do 10%, należy zastosować wzór korekcyjny Abbotta68.
Metoda opisana przez Ramara i in. 69 została użyta do biotestu na dorosłych osobnikach Aedes aegypti przy użyciu acetonu jako rozpuszczalnika. Każdy olejek eteryczny został początkowo przetestowany na dorosłych osobnikach komarów Aedes aegypti w stężeniach 100 i 1000 ppm. Nanieś 2 ml każdego przygotowanego roztworu na liczbę Whatmana. 1 kawałek bibuły filtracyjnej (rozmiar 12 x 15 cm2) i pozwól acetonowi odparować przez 10 minut. Bibułę filtracyjną potraktowaną tylko 2 ml acetonu użyto jako kontrolę. Po odparowaniu acetonu potraktowaną bibułę filtracyjną i kontrolną bibułę filtracyjną umieszczono w cylindrycznej probówce (głębokość 10 cm). Dziesięć 3-4-dniowych komarów nieżywiących się krwią przeniesiono do trzech kopii każdego stężenia. Na podstawie wyników wstępnych testów przetestowano różne stężenia wybranych olejków. Śmiertelność rejestrowano po 1 godzinie, 2 godzinach, 3 godzinach, 4 godzinach, 5 godzinach, 6 godzinach, 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach od uwolnienia komarów. Oblicz wartości LC50 dla czasów ekspozycji 24 godziny, 48 godzin i 72 godzin. Jeśli śmiertelność partii kontrolnej przekroczy 20%, powtórz cały test. Podobnie, jeśli śmiertelność w grupie kontrolnej jest większa niż 5%, dostosuj wyniki dla próbek poddanych działaniu preparatu, stosując wzór Abbotta68.
Chromatografia gazowa (Agilent 7890A) i spektrometria masowa (Accu TOF GCv, Jeol) zostały wykonane w celu analizy związków składowych wybranych olejków eterycznych. GC był wyposażony w detektor FID i kolumnę kapilarną (HP5-MS). Gazem nośnym był hel, szybkość przepływu wynosiła 1 ml/min. Program GC ustala dla Allium sativum 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M, dla Ocimum Sainttum 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, dla mięty 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, dla eukaliptusa 20,60-1M-10-200-3M-30-280, a dla czerwieni Dla tysiąca warstw są to 10: 60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
Główne związki każdego olejku eterycznego zidentyfikowano na podstawie procentowej powierzchni obliczonej na podstawie wyników chromatogramu GC i spektrometrii masowej (w odniesieniu do bazy danych standardów NIST 70).
Dwa główne związki w każdym EO wybrano na podstawie wyników GC-MS i zakupiono od Sigma-Aldrich o czystości 98–99% do dalszych biotestów. Związki przetestowano pod kątem skuteczności larwicydowej i wobec osobników dorosłych przeciwko Aedes aegypti, jak opisano powyżej. Najczęściej stosowane syntetyczne larwicydy tamefosat (Sigma Aldrich) i lek dla osobników dorosłych malation (Sigma Aldrich) zostały przeanalizowane w celu porównania ich skuteczności z wybranymi związkami EO, zgodnie z tą samą procedurą.
Mieszaniny binarne wybranych związków terpenowych i związków terpenowych plus komercyjnych organofosforanów (tilefos i malation) przygotowano przez zmieszanie dawki LC50 każdego związku kandydującego w stosunku 1:1. Przygotowane kombinacje testowano na stadiach larwalnych i dorosłych Aedes aegypti, jak opisano powyżej. Każdy biotest przeprowadzono trzykrotnie dla każdej kombinacji i trzykrotnie dla poszczególnych związków obecnych w każdej kombinacji. Śmierć owadów docelowych odnotowano po 24 godzinach. Oblicz oczekiwany współczynnik śmiertelności dla mieszaniny binarnej, korzystając z następującego wzoru.
gdzie E = oczekiwany współczynnik śmiertelności komarów Aedes aegypti w odpowiedzi na kombinację binarną, tj. połączenie (A + B).
Efekt każdej mieszanki binarnej został oznaczony jako synergistyczny, antagonistyczny lub brak efektu na podstawie wartości χ2 obliczonej metodą opisaną przez Pavla52. Oblicz wartość χ2 dla każdej kombinacji, używając następującego wzoru.
Efekt kombinacji zdefiniowano jako synergistyczny, gdy obliczona wartość χ2 była większa niż wartość z tabeli dla odpowiadających stopni swobody (95% przedział ufności) i jeśli zaobserwowana śmiertelność przekraczała oczekiwaną śmiertelność. Podobnie, jeśli obliczona wartość χ2 dla dowolnej kombinacji przekracza wartość z tabeli przy pewnych stopniach swobody, ale zaobserwowana śmiertelność jest niższa niż oczekiwana śmiertelność, leczenie uważa się za antagonistyczne. A jeśli w dowolnej kombinacji obliczona wartość χ2 jest mniejsza niż wartość z tabeli w odpowiadających stopniach swobody, kombinacja uważa się za niemającą żadnego efektu.
Wybrano trzy do czterech potencjalnie synergistycznych kombinacji (100 larw i 50 larwobójczych i dorosłych owadów) do testowania na dużej liczbie owadów. Dorosłe osobniki) postępować jak powyżej. Oprócz mieszanin, poszczególne związki obecne w wybranych mieszankach zostały również przetestowane na równej liczbie larw i dorosłych osobników Aedes aegypti. Stosunek kombinacji wynosi jedną część dawki LC50 jednego związku kandydującego i część dawki LC50 drugiego związku składowego. W bioteście aktywności dorosłych wybrane związki rozpuszczono w rozpuszczalniku acetonie i nałożono na bibułę filtracyjną owiniętą w cylindryczny plastikowy pojemnik o pojemności 1300 cm3. Aceton odparowano przez 10 minut, a dorosłe osobniki uwolniono. Podobnie w bioteście larwobójczym dawki związków kandydujących LC50 zostały najpierw rozpuszczone w równych objętościach DMSO, a następnie zmieszane z 1 litrem wody przechowywanej w plastikowych pojemnikach o pojemności 1300 cm3, a larwy zostały uwolnione.
Do obliczenia wartości LC50 wykorzystano analizę probabilistyczną 71 zarejestrowanych danych dotyczących śmiertelności, wykorzystując w tym celu oprogramowanie SPSS (wersja 16) i Minitab.
Czas publikacji: 01-07-2024