Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Kombinacje związków owadobójczych pochodzenia roślinnego mogą wykazywać synergistyczne lub antagonistyczne interakcje ze szkodnikami. Biorąc pod uwagę szybkie rozprzestrzenianie się chorób przenoszonych przez komary z rodzaju Aedes i rosnącą odporność populacji komarów z rodzaju Aedes na tradycyjne insektycydy, opracowano dwadzieścia osiem kombinacji związków terpenowych na bazie olejków eterycznych roślin i przetestowano je na larwach i osobnikach dorosłych komara Aedes aegypti. Pięć olejków eterycznych roślinnych (EO) wstępnie oceniono pod kątem ich skuteczności larwobójczej i działania na osobniki dorosłe, a w każdym z nich zidentyfikowano dwa główne związki na podstawie wyników GC-MS. Zakupiono główne zidentyfikowane związki, a mianowicie disiarczek diallilu, trisiarczek diallilu, karwon, limonen, eugenol, metyloeugenol, eukaliptol, eudesmol i alfa-pinen komarów. Następnie przygotowano binarne kombinacje tych związków w dawkach subletalnych, a następnie zbadano i określono ich synergistyczne i antagonistyczne działanie. Najlepsze kompozycje larwobójcze uzyskuje się poprzez zmieszanie limonenu z disiarczkiem diallilu, a najlepsze kompozycje zwalczające osobniki dorosłe – poprzez zmieszanie karwonu z limonenem. Komercyjnie stosowany syntetyczny larwicyd Temphos oraz lek na osobniki dorosłe Malation testowano oddzielnie oraz w kombinacjach binarnych z terpenoidami. Wyniki wykazały, że połączenie temefosu i disiarczku diallilu oraz malationu i eudesmolu było najskuteczniejsze. Te silne kombinacje mają potencjał do zastosowania przeciwko komarowi Aedes aegypti.
Olejki eteryczne roślin (EO) to metabolity wtórne zawierające różne związki bioaktywne i stają się coraz ważniejszym zamiennikiem syntetycznych pestycydów. Są nie tylko przyjazne dla środowiska i użytkownika, ale stanowią również mieszaninę różnych związków bioaktywnych, co dodatkowo zmniejsza prawdopodobieństwo rozwoju lekooporności1. Wykorzystując technologię GC-MS, naukowcy zbadali składniki różnych olejków eterycznych roślin i zidentyfikowali ponad 3000 związków pochodzących z 17 500 roślin aromatycznych2, z których większość została przebadana pod kątem właściwości owadobójczych i stwierdzono, że mają one działanie owadobójcze3,4. Niektóre badania wskazują, że toksyczność głównego składnika związku jest taka sama lub większa niż toksyczność jego surowego tlenku etylenu. Jednak stosowanie pojedynczych związków może ponownie stworzyć przestrzeń dla rozwoju oporności, jak ma to miejsce w przypadku chemicznych insektycydów5,6. Dlatego obecnie koncentrujemy się na przygotowywaniu mieszanin związków na bazie tlenku etylenu w celu poprawy skuteczności insektycydów i zmniejszenia prawdopodobieństwa wystąpienia oporności w docelowych populacjach szkodników. Poszczególne związki aktywne obecne w olejkach eterycznych mogą wykazywać działanie synergistyczne lub antagonistyczne w kombinacjach, odzwierciedlając ogólną aktywność olejku eterycznego, co zostało dobrze podkreślone w badaniach przeprowadzonych przez poprzednich badaczy7,8. Program zwalczania wektorów obejmuje również olejki eteryczne i ich składniki. Działanie komarobójcze olejków eterycznych zostało szeroko zbadane w odniesieniu do komarów z rodzaju Culex i Anopheles. W kilku badaniach podjęto próbę opracowania skutecznych pestycydów poprzez połączenie różnych roślin z komercyjnie stosowanymi pestycydami syntetycznymi w celu zwiększenia ogólnej toksyczności i zminimalizowania skutków ubocznych9. Jednak badania nad takimi związkami przeciwko komarowi Aedes aegypti pozostają rzadkie. Postęp w naukach medycznych oraz rozwój leków i szczepionek pomogły w zwalczaniu niektórych chorób przenoszonych przez wektory. Jednak obecność różnych serotypów wirusa przenoszonego przez komara Aedes aegypti doprowadziła do niepowodzenia programów szczepień. Dlatego w przypadku wystąpienia takich chorób, programy zwalczania wektorów są jedyną opcją zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby. W obecnej sytuacji kontrola Aedes aegypti jest niezwykle ważna, ponieważ jest to kluczowy wektor różnych wirusów i ich serotypów powodujących dengę, Zika, gorączkę krwotoczną dengi, żółtą febrę itp. Najbardziej godnym uwagi jest fakt, że liczba przypadków prawie wszystkich chorób przenoszonych przez wektory Aedes rośnie z roku na rok w Egipcie i na całym świecie. Dlatego w tym kontekście istnieje pilna potrzeba opracowania przyjaznych dla środowiska i skutecznych środków kontroli populacji Aedes aegypti. Potencjalnymi kandydatami w tym zakresie są olejki eteryczne, ich związki składowe oraz ich kombinacje. Dlatego w niniejszym badaniu podjęto próbę zidentyfikowania skutecznych synergistycznych kombinacji kluczowych roślinnych olejków eterycznych z pięciu roślin o właściwościach owadobójczych (tj. mięty, bazylii świętej, eukaliptusa plamistego, czosnku pospolitego i drzewa herbacianego) przeciwko Aedes aegypti.
Wszystkie wybrane olejki eteryczne wykazały potencjalną aktywność larwobójczą wobec komara Aedes aegypti, przy czym LC50 po 24 godzinach wynosiło od 0,42 do 163,65 ppm. Najwyższą aktywność larwobójczą odnotowano dla olejku eterycznego z mięty pieprzowej (Mp) z wartością LC50 wynoszącą 0,42 ppm po 24 godzinach, a następnie dla czosnku (As) z wartością LC50 wynoszącą 16,19 ppm po 24 godzinach (Tabela 1).
Z wyjątkiem olejku eterycznego Os z Ocimum Sainttum, wszystkie cztery przebadane olejki eteryczne wykazały wyraźne działanie alercydalne, z wartościami LC50 w zakresie od 23,37 do 120,16 ppm w ciągu 24 godzin ekspozycji. Olejek eteryczny Thymophilus striata (Cl) okazał się najskuteczniejszy w zabijaniu dorosłych osobników z wartością LC50 równą 23,37 ppm w ciągu 24 godzin od ekspozycji, a następnie Eucalyptus maculata (Em), którego wartość LC50 wyniosła 101,91 ppm (Tabela 1). Z drugiej strony, wartość LC50 dla olejku eterycznego Os nie została jeszcze określona, ponieważ najwyższy wskaźnik śmiertelności, wynoszący 53%, odnotowano przy najwyższej dawce (Rysunek uzupełniający 3).
Dwa główne związki składowe każdego EO zidentyfikowano i wybrano na podstawie wyników z bazy danych biblioteki NIST, procentowej powierzchni chromatogramu GC i wyników widm MS (Tabela 2). W przypadku EO As głównymi zidentyfikowanymi związkami były disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu; w przypadku EO Mp głównymi zidentyfikowanymi związkami były karwon i limonen; w przypadku EO Em głównymi zidentyfikowanymi związkami były eudesmol i eukaliptol; w przypadku EO Os głównymi zidentyfikowanymi związkami były eugenol i metyloeugenol, a w przypadku EO Cl głównymi zidentyfikowanymi związkami były eugenol i α-pinen (Rysunek 1, Rysunki uzupełniające 5–8, Tabela uzupełniająca 1–5).
Wyniki spektrometrii masowej głównych terpenoidów wybranych olejków eterycznych (A-diallilowy disulfid; B-diallilowy trisulfid; C-eugenol; D-metyloeugenol; E-limonen; F-aromatyczny ceperon; G-α-pinen; H-cyneol; R-eudamol).
Łącznie dziewięć związków (disiarczek diallilu, trisiarczek diallilu, eugenol, metyloeugenol, karwon, limonen, eukaliptol, eudesmol, α-pinen) zidentyfikowano jako skuteczne związki będące głównymi składnikami olejków eterycznych i poddano je indywidualnym testom biologicznym przeciwko Aedes aegypti w stadium larwalnym. Związek eudesmol wykazywał najwyższą aktywność larwobójczą, z wartością LC50 równą 2,25 ppm po 24 godzinach ekspozycji. Stwierdzono również, że związki disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu mają potencjalne działanie larwobójcze, przy średnich dawkach subletalnych w zakresie 10–20 ppm. Umiarkowaną aktywność larwobójczą ponownie zaobserwowano dla związków eugenolu, limonenu i eukaliptolu, z wartościami LC50 wynoszącymi odpowiednio 63,35 ppm, 139,29 ppm i 181,33 ppm po 24 godzinach (tabela 3). Jednak nie stwierdzono istotnego potencjału larwobójczego metyloeugenolu i karwonu nawet przy najwyższych dawkach, dlatego wartości LC50 nie zostały obliczone (tabela 3). Syntetyczny larwicyd Temephos miał średnie stężenie śmiertelne dla Aedes aegypti wynoszące 0,43 ppm po 24 godzinach ekspozycji (tabela 3, tabela uzupełniająca 6).
Siedem związków (disiarczek diallilu, trisiarczek diallilu, eukaliptol, α-pinen, eudesmol, limonen i karwon) zidentyfikowano jako główne związki skutecznego olejku eterycznego i przetestowano je indywidualnie na dorosłych komarach egipskich Aedes. Zgodnie z analizą regresji Probit, Eudesmol wykazał najwyższy potencjał z wartością LC50 wynoszącą 1,82 ppm, a następnie Eukaliptol z wartością LC50 wynoszącą 17,60 ppm po 24-godzinnej ekspozycji. Pozostałe pięć badanych związków było umiarkowanie szkodliwych dla dorosłych osobników, z wartościami LC50 w zakresie od 140,79 do 737,01 ppm (Tabela 3). Syntetyczny malation fosforoorganiczny okazał się mniej silny niż eudesmol, ale silniejszy niż sześć pozostałych związków, przy czym wartość LC50 wyniosła 5,44 ppm w okresie 24-godzinnej ekspozycji (Tabela 3, Tabela uzupełniająca 6).
Siedem silnych związków ołowiu i organofosforowy tamefosat wybrano do sformułowania binarnych kombinacji ich dawek LC50 w stosunku 1:1. Łącznie przygotowano 28 binarnych kombinacji i przetestowano ich skuteczność larwobójczą wobec komara Aedes aegypti. Dziewięć kombinacji okazało się synergistycznych, 14 antagonistycznych, a pięć nie wykazało działania larwobójczego. Spośród synergistycznych kombinacji, kombinacja disiarczku diallilu i temofolu okazała się najskuteczniejsza, ze 100% śmiertelnością obserwowaną po 24 godzinach (Tabela 4). Podobnie, mieszaniny limonenu z disiarczkiem diallilu oraz eugenolu z tymefosem wykazały dobry potencjał, ze obserwowaną śmiertelnością larw na poziomie 98,3% (Tabela 5). Pozostałe 4 kombinacje, mianowicie eudesmol plus eukaliptol, eudesmol plus limonen, eukaliptol plus alfa-pinen, alfa-pinen plus temefos, również wykazały znaczną skuteczność larwobójczą, przy obserwowanych wskaźnikach śmiertelności przekraczających 90%. Oczekiwany wskaźnik śmiertelności wynosi około 60-75%. (Tabela 4). Jednakże połączenie limonenu z α-pinenem lub eukaliptusem wykazało reakcje antagonistyczne. Podobnie stwierdzono, że mieszaniny temefosu z eugenolem lub eukaliptusem, eudesmolem lub trisulfidem diallilu mają działanie antagonistyczne. Podobnie, połączenie disulfidu diallilu i trisulfidu diallilu oraz połączenie któregokolwiek z tych związków z eudesmolem lub eugenolem wykazują antagonistyczne działanie larwobójcze. Antagonizm odnotowano również w przypadku połączenia eudesmolu z eugenolem lub α-pinenem.
Spośród wszystkich 28 mieszanin binarnych badanych pod kątem aktywności kwasowej u dorosłych, 7 kombinacji działało synergistycznie, 6 nie miało żadnego efektu, a 15 antagonistycznie. Stwierdzono, że mieszaniny eudesmolu z eukaliptusem oraz limonenu z karwonem były skuteczniejsze niż inne kombinacje synergistyczne, ze wskaźnikami śmiertelności po 24 godzinach wynoszącymi odpowiednio 76% i 100% (Tabela 5). Zaobserwowano, że malation wykazuje działanie synergistyczne ze wszystkimi kombinacjami związków z wyjątkiem limonenu i trisulfidu diallilu. Z drugiej strony, stwierdzono antagonizm między disulfidem diallilu i trisulfidem diallilu oraz połączeniem któregokolwiek z nich z eukaliptusem, eukaliptolem, karwonem lub limonenem. Podobnie, połączenia α-pinenu z eudesmolem lub limonenem, eukaliptolu z karwonem lub limonenem oraz limonenu z eudesmolem lub malationem wykazywały antagonistyczne działanie larwobójcze. W przypadku pozostałych sześciu połączeń nie stwierdzono istotnej różnicy między oczekiwaną a obserwowaną śmiertelnością (Tabela 5).
Na podstawie efektów synergistycznych i dawek subletalnych ostatecznie wybrano i dalej testowano ich toksyczność larwobójczą wobec dużej liczby komarów Aedes aegypti. Wyniki pokazały, że obserwowana śmiertelność larw przy zastosowaniu kombinacji binarnych eugenol-limonen, disiarczek diallilu-limonen i disiarczek diallilu-timefos wyniosła 100%, podczas gdy oczekiwana śmiertelność larw wyniosła odpowiednio 76,48%, 72,16% i 63,4% (Tabela 6). Połączenie limonenu i eudesmolu było stosunkowo mniej skuteczne, przy czym zaobserwowano 88% śmiertelność larw w ciągu 24-godzinnego okresu ekspozycji (Tabela 6). Podsumowując, cztery wybrane kombinacje binarne wykazały również synergistyczne efekty larwobójcze wobec Aedes aegypti po zastosowaniu na dużą skalę (Tabela 6).
Do biotestu bójczego na osobniki dorosłe wybrano trzy synergistyczne kombinacje, mające na celu zwalczanie dużych populacji dorosłych osobników Aedes aegypti. Aby wybrać kombinacje do przetestowania na dużych koloniach owadów, skupiliśmy się najpierw na dwóch najlepiej synergistycznych kombinacjach terpenów, a mianowicie karwonie z limonenem oraz eukaliptolu z eudesmolem. Następnie, najlepszą synergistyczną kombinację wybrano spośród kombinacji syntetycznego organofosforanowego malationu i terpenoidów. Uważamy, że połączenie malationu i eudesmolu jest najlepszą kombinacją do testowania na dużych koloniach owadów ze względu na najwyższą obserwowaną śmiertelność i bardzo niskie wartości LC50 badanych składników. Malation wykazuje synergizm w połączeniu z α-pinenem, disiarczkiem diallilu, eukaliptusem, karwonem i eudesmolem. Jednak jeśli spojrzymy na wartości LC50, Eudesmol ma najniższą wartość (2,25 ppm). Obliczone wartości LC50 malationu, α-pinenu, disiarczku diallilu, eukaliptolu i karwonu wyniosły odpowiednio 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 i 140,79 ppm. Wartości te wskazują, że połączenie malationu i eudesmolu jest optymalne pod względem dawkowania. Wyniki wykazały, że połączenia karwonu z limonenem oraz eudesmolu z malationem miały 100% obserwowanej śmiertelności w porównaniu z oczekiwaną śmiertelnością na poziomie 61% do 65%. Inna kombinacja, eudesmol z eukaliptolem, wykazała wskaźnik śmiertelności na poziomie 78,66% po 24 godzinach ekspozycji, w porównaniu z oczekiwaną śmiertelnością na poziomie 60%. Wszystkie trzy wybrane kombinacje wykazały działanie synergistyczne nawet po zastosowaniu na dużą skalę przeciwko dorosłym komarom Aedes aegypti (Tabela 6).
W niniejszym badaniu wybrane olejki eteryczne roślin, takie jak Mp, As, Os, Em i Cl, wykazały obiecujące działanie śmiertelne na larwy i osobniki dorosłe komara Aedes aegypti. Olejek eteryczny Mp wykazywał najwyższą aktywność larwobójczą, z wartością LC50 0,42 ppm, a następnie olejki eteryczne As, Os i Em z wartością LC50 poniżej 50 ppm po 24 godzinach. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami komarów i innych muchówek10,11,12,13,14. Chociaż potencjał larwobójczy Cl jest niższy niż innych olejków eterycznych, z wartością LC50 163,65 ppm po 24 godzinach, jego potencjał dla osobników dorosłych jest najwyższy, z wartością LC50 23,37 ppm po 24 godzinach. Olejki eteryczne Mp, As i Em również wykazały dobry potencjał alercydowy przy wartościach LC50 w zakresie 100–120 ppm po 24 godzinach ekspozycji, ale były stosunkowo niższe od ich skuteczności larwobójczej. Z drugiej strony, olejki eteryczne Os wykazały nieistotne działanie alercydowe nawet przy najwyższej dawce terapeutycznej. Tak więc wyniki wskazują, że toksyczność tlenku etylenu dla roślin może się różnić w zależności od etapu rozwoju komarów15. Zależy to również od szybkości przenikania olejków eterycznych do organizmu owada, ich interakcji ze specyficznymi enzymami docelowymi oraz zdolności detoksykacyjnej komara na każdym etapie rozwoju16. Wiele badań wykazało, że główny związek składowy jest ważnym czynnikiem w biologicznej aktywności tlenku etylenu, ponieważ stanowi większość całkowitych związków3,12,17,18. Dlatego rozważyliśmy dwa główne związki w każdym olejku eterycznym. Na podstawie wyników GC-MS, disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu zostały zidentyfikowane jako główne związki EO As, co jest zgodne z wcześniejszymi raportami19,20,21. Chociaż wcześniejsze raporty wskazywały, że mentol był jednym z jego głównych związków, karwon i limonen zostały ponownie zidentyfikowane jako główne związki Mp EO22,23. Profil składu Os EO wykazał, że eugenol i metyloeugenol są głównymi związkami, co jest podobne do ustaleń wcześniejszych badaczy16,24. Eukaliptol i eukaliptol zostały zgłoszone jako główne związki obecne w olejku z liści Em, co jest zgodne z wynikami niektórych badaczy25,26, ale sprzeczne z wynikami Olalade i in.27. Dominację cyneolu i α-pinenu zaobserwowano w olejku eterycznym z drzewa herbacianego, co jest podobne do wyników wcześniejszych badań28,29. Zgłaszano wewnątrzgatunkowe różnice w składzie i stężeniu olejków eterycznych ekstrahowanych z tych samych gatunków roślin w różnych lokalizacjach, które również zaobserwowano w tym badaniu. Różnice te zależą od geograficznych warunków wzrostu roślin, czasu zbiorów, fazy rozwojowej lub wieku rośliny, wyglądu chemotypów itp.22,30,31,32. Kluczowe zidentyfikowane związki zakupiono i przetestowano pod kątem ich działania larwobójczego oraz wpływu na dorosłe komary Aedes aegypti. Wyniki wykazały, że aktywność larwobójcza disiarczku diallilu była porównywalna z aktywnością surowego EO As. Jednak aktywność trisiarczku diallilu jest wyższa niż EO As. Wyniki te są podobne do wyników uzyskanych przez Kimbaris i in. 33 dla Culex philippines. Jednakże te dwa związki nie wykazały dobrej aktywności autobójczej wobec komarów docelowych, co jest zgodne z wynikami Plata-Rueda i in. 34 dla Tenebrio molitor. Os EO jest skuteczny przeciwko larwom Aedes aegypti, ale nie przeciwko stadium dorosłemu. Ustalono, że aktywność larwobójcza głównych pojedynczych związków jest niższa niż surowego Os EO. Sugeruje to rolę innych związków i ich interakcji w surowym tlenku etylenu. Sam metyloeugenol ma znikomą aktywność, podczas gdy sam eugenol ma umiarkowaną aktywność larwobójczą. Wniosek ten z jednej strony potwierdza35,36, a z drugiej przeczy wnioskom wcześniejszych badaczy37,38. Różnice w grupach funkcyjnych eugenolu i metyloeugenolu mogą prowadzić do różnej toksyczności dla tego samego owada docelowego39. Stwierdzono, że limonen ma umiarkowaną aktywność larwobójczą, podczas gdy wpływ karwonu był nieistotny. Podobnie, stosunkowo niska toksyczność limonenu dla owadów dorosłych i wysoka toksyczność karwonu potwierdzają wyniki niektórych wcześniejszych badań40, ale przeczą innym41. Obecność podwójnych wiązań zarówno w pozycjach wewnątrzcyklicznych, jak i egzocyklicznych może zwiększać korzyści płynące ze stosowania tych związków jako larwicydów3,41, podczas gdy karwon, który jest ketonem z nienasyconymi atomami węgla alfa i beta, może wykazywać wyższy potencjał toksyczności u osobników dorosłych42. Jednakże indywidualne właściwości limonenu i karwonu są znacznie niższe niż całkowita wartość Mp EO (Tabela 1, Tabela 3). Spośród badanych terpenoidów eudesmol wykazał największą aktywność larwicydową i aktywność wobec osobników dorosłych, przy wartości LC50 poniżej 2,5 ppm, co czyni go obiecującym związkiem w zwalczaniu komarów Aedes. Jego działanie jest lepsze niż całego EO Em, chociaż nie jest to zgodne z wynikami badań Cheng i in.40. Eudesmol to seskwiterpen z dwiema jednostkami izoprenowymi, który jest mniej lotny niż utlenione monoterpeny, takie jak eukaliptus, a zatem ma większy potencjał jako pestycyd. Eukaliptol sam w sobie ma większą aktywność dorosłych osobników niż larwobójczą, a wyniki wcześniejszych badań zarówno to potwierdzają, jak i obalają37,43,44. Sama aktywność jest niemal porównywalna z aktywnością całego EO Cl. Inny bicykliczny monoterpen, α-pinen, ma mniejszy wpływ na dorosłe osobniki Aedes aegypti niż działanie larwobójcze, co jest przeciwieństwem działania pełnego EO Cl. Na ogólną aktywność owadobójczą terpenoidów wpływa ich lipofilowość, lotność, rozgałęzienia węglowe, powierzchnia projekcji, powierzchnia właściwa, grupy funkcyjne i ich położenie45,46. Związki te mogą działać poprzez niszczenie akumulacji komórek, blokowanie aktywności oddechowej, przerywanie przekazywania impulsów nerwowych itp.47 Stwierdzono, że syntetyczny organofosforan Temephos ma najwyższą aktywność larwobójczą z wartością LC50 wynoszącą 0,43 ppm, co jest zgodne z danymi Leka -Utala48. Aktywność syntetycznego malationu fosforoorganicznego u osobników dorosłych wyniosła 5,44 ppm. Chociaż te dwa związki fosforoorganiczne wykazały korzystne działanie przeciwko laboratoryjnym szczepom Aedes aegypti, w różnych częściach świata odnotowano oporność komarów na te związki49. Nie odnotowano jednak podobnych doniesień o rozwoju oporności na leki ziołowe50. Dlatego też środki botaniczne są uważane za potencjalną alternatywę dla pestycydów chemicznych w programach zwalczania wektorów.
Działanie larwobójcze testowano na 28 kombinacjach binarnych (1:1) przygotowanych z silnych terpenoidów i terpenoidów z tymetopsem. Stwierdzono, że 9 kombinacji działa synergistycznie, 14 antagonistycznie, a 5 antagonistycznie. Brak działania. Z drugiej strony, w biopróbie potencjału na osobnikach dorosłych stwierdzono, że 7 kombinacji działa synergistycznie, 15 antagonistycznie, a 6 kombinacji nie działa. Powodem, dla którego pewne kombinacje wywołują działanie synergistyczne, może być jednoczesne oddziaływanie związków kandydackich na różne ważne szlaki lub sekwencyjne hamowanie różnych kluczowych enzymów określonego szlaku biologicznego51. Stwierdzono, że połączenie limonenu z disiarczkiem diallilu, eukaliptusem lub eugenolem działa synergistycznie zarówno w zastosowaniach na małą, jak i dużą skalę (Tabela 6), podczas gdy jego połączenie z eukaliptusem lub α-pinenem miało antagonistyczne działanie na larwy. Średnio rzecz biorąc, limonen wydaje się być dobrym synergistą, prawdopodobnie ze względu na obecność grup metylowych, dobrą penetrację do warstwy rogowej naskórka i inny mechanizm działania52,53. Wcześniej donoszono, że limonen może wywoływać skutki toksyczne poprzez penetrację kutykuli owadów (toksyczność kontaktowa), wpływ na układ pokarmowy (środek antyfidacyjny) lub wpływ na układ oddechowy (działanie fumigacyjne),54 natomiast fenylopropanoidy, takie jak eugenol, mogą wpływać na enzymy metaboliczne55. Dlatego też połączenia związków o różnych mechanizmach działania mogą zwiększać ogólny efekt śmiertelny mieszaniny. Stwierdzono, że eukaliptol działa synergistycznie z disiarczkiem diallilu, eukaliptusem lub α-pinenem, ale inne połączenia z innymi związkami były albo nielarwicydowe, albo antagonistyczne. Wczesne badania wykazały, że eukaliptol wykazuje działanie hamujące na acetylocholinoesterazę (AChE), a także na receptory oktaaminy i GABA56. Ponieważ cykliczne monoterpeny, takie jak eukaliptol, eugenol itp., mogą mieć ten sam mechanizm działania, co ich aktywność neurotoksyczna,57 minimalizując w ten sposób ich łączne działanie poprzez wzajemne hamowanie. Podobnie stwierdzono, że połączenie temefosu z disiarczkiem diallilu, α-pinenem i limonenem działa synergistycznie, co potwierdza wcześniejsze doniesienia o synergistycznym działaniu między produktami ziołowymi a syntetycznymi organofosforanami58.
Stwierdzono, że połączenie eudesmolu i eukaliptolu ma synergistyczne działanie na larwy i osobniki dorosłe Aedes aegypti, prawdopodobnie ze względu na ich różne tryby działania wynikające z ich odmiennej struktury chemicznej. Eudesmol (seskwiterpen) może wpływać na układ oddechowy59, a eukaliptol (monoterpen) może wpływać na acetylocholinoesterazę60. Jednoczesna ekspozycja składników na dwa lub więcej miejsc docelowych może nasilić ogólny efekt letalny połączenia. W biotestach substancji dorosłych stwierdzono, że malation działa synergicznie z karwonem lub eukaliptolem lub eukaliptolem lub disiarczkiem diallilu lub α-pinenem, co wskazuje, że działa synergicznie z dodatkiem limonenu i di. Dobre synergistyczne kandydaty na alergocydy dla całego portfolio związków terpenowych, z wyjątkiem trisiarczku allilu. Thangam i Kathiresan61 również zaobserwowali podobne wyniki synergistycznego działania malationu z ekstraktami ziołowymi. Ta synergistyczna reakcja może wynikać z połączonego toksycznego działania malationu i fitozwiązków na enzymy detoksykujące owadów. Organofosforany, takie jak malation, działają zazwyczaj poprzez hamowanie esteraz i monooksygenaz cytochromu P45062,63,64. Dlatego połączenie malationu o tych mechanizmach działania z terpenami o innych mechanizmach działania może nasilać ogólny efekt śmiertelny dla komarów.
Z drugiej strony, antagonizm wskazuje, że wybrane związki są mniej aktywne w połączeniu niż każdy związek osobno. Powodem antagonizmu w niektórych połączeniach może być to, że jeden związek modyfikuje zachowanie drugiego związku, zmieniając szybkość wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu lub wydalania. Wcześni badacze uważali to za przyczynę antagonizmu w połączeniach leków. Cząsteczki Możliwy mechanizm 65. Podobnie, możliwe przyczyny antagonizmu mogą być związane z podobnymi mechanizmami działania, konkurencją związków składowych o ten sam receptor lub miejsce docelowe. W niektórych przypadkach może również wystąpić niekompetycyjne hamowanie białka docelowego. W tym badaniu dwa związki siarki organicznej, disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu, wykazały działanie antagonistyczne, prawdopodobnie z powodu konkurencji o to samo miejsce docelowe. Podobnie, te dwa związki siarki wykazały działanie antagonistyczne i nie miały działania w połączeniu z eudesmolem i α-pinenem. Eudesmol i alfa-pinen mają charakter cykliczny, natomiast disiarczek diallilu i trisiarczek diallilu mają charakter alifatyczny. Biorąc pod uwagę strukturę chemiczną, połączenie tych związków powinno zwiększyć ogólną aktywność letalną, ponieważ ich miejsca docelowe są zazwyczaj różne34,47, ale eksperymentalnie stwierdziliśmy antagonizm, który może wynikać z roli tych związków w niektórych nieznanych organizmach in vivo w wyniku interakcji. Podobnie, połączenie cyneolu i α-pinenu wywołało reakcje antagonistyczne, chociaż naukowcy wcześniej donosili, że oba związki mają różne cele działania47,60. Ponieważ oba związki są cyklicznymi monoterpenami, mogą istnieć pewne wspólne miejsca docelowe, które mogą konkurować o wiązanie i wpływać na ogólną toksyczność badanych par kombinatorycznych.
Na podstawie wartości LC50 i obserwowanej śmiertelności wybrano dwie najlepiej synergistyczne kombinacje terpenów, a mianowicie pary karwon + limonen i eukaliptol + eudesmol, a także syntetyczny malation organofosforowy z terpenami. Optymalną synergistyczną kombinację związków malation + eudesmol przetestowano w bioteście dorosłych insektycydów. Celowano w duże kolonie owadów, aby potwierdzić, czy te skuteczne kombinacje mogą działać przeciwko dużej liczbie osobników na stosunkowo dużych powierzchniach ekspozycji. Wszystkie te kombinacje wykazują synergistyczne działanie przeciwko dużym rojom owadów. Podobne wyniki uzyskano dla optymalnej synergistycznej kombinacji larwobójczej testowanej na dużych populacjach larw Aedes aegypti. Można zatem stwierdzić, że skuteczna synergistyczna kombinacja larwobójcza i dorosłych związków olejków eterycznych roślin jest silnym kandydatem przeciwko istniejącym syntetycznym chemikaliom i może być dalej stosowana do zwalczania populacji Aedes aegypti. Podobnie, skuteczne kombinacje syntetycznych larwicydów lub adultycydów z terpenami mogą być również stosowane w celu zmniejszenia dawek tymetofosu lub malationu podawanych komarom. Te silne, synergistyczne kombinacje mogą stanowić rozwiązanie dla przyszłych badań nad ewolucją lekooporności u komarów z rodzaju Aedes.
Jaja komara Aedes aegypti pobrano z Regionalnego Centrum Badań Medycznych w Dibrugarh, należącego do Indyjskiej Rady Badań Medycznych, i przechowywano w kontrolowanej temperaturze (28 ± 1°C) i wilgotności (85 ± 5%) na Wydziale Zoologii Uniwersytetu Gauhati w następujących warunkach: Arivoli i in. opisali to Arivoli i in. Po wykluciu larwy karmiono pokarmem dla larw (proszek z psich herbatników i drożdże w stosunku 3:1), a osobniki dorosłe 10% roztworem glukozy. Począwszy od 3. dnia po wykluciu, dorosłym samicom komarów pozwolono ssać krew szczurów albinotycznych. Namocz bibułę filtracyjną w wodzie w szklance i umieść ją w klatce do składania jaj.
Wybrane próbki roślin, a mianowicie liście eukaliptusa (Myrtaceae), bazylii świętej (Lamiaceae), mięty (Lamiaceae), drzewa herbacianego (Myrtaceae) oraz cebulki czosnku (Amaryllidaceae). Zebrano je w Guwahati i zidentyfikowano na Wydziale Botaniki Uniwersytetu Gauhati. Zebrane próbki roślin (500 g) poddano hydrodestylacji w aparacie Clevengera przez 6 godzin. Wyekstrahowany olejek eteryczny zebrano do czystych szklanych fiolek i przechowywano w temperaturze 4°C do dalszych badań.
Toksyczność larwobójczą badano stosując nieznacznie zmodyfikowane standardowe procedury Światowej Organizacji Zdrowia67. Jako emulgatora używaj DMSO. Każde stężenie EO testowano początkowo przy stężeniu 100 i 1000 ppm, eksponując 20 larw w każdym powtórzeniu. Na podstawie wyników przyjęto zakres stężeń i rejestrowano śmiertelność od 1 godziny do 6 godzin (w odstępach 1-godzinnych) oraz po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach od zabiegu. Stężenia subletalne (LC50) określano po 24, 48 i 72 godzinach od ekspozycji. Każde stężenie testowano trzykrotnie wraz z jedną kontrolą negatywną (tylko woda) i jedną kontrolą pozytywną (woda traktowana DMSO). Jeśli wystąpi przepoczwarczenie i umrze więcej niż 10% larw z grupy kontrolnej, eksperyment powtarza się. Jeśli śmiertelność w grupie kontrolnej wynosi od 5 do 10%, należy zastosować wzór korekcyjny Abbotta68.
Metodę opisaną przez Ramara i in. 69 zastosowano do biotestu na dorosłych osobnikach komarów Aedes aegypti z użyciem acetonu jako rozpuszczalnika. Każdy olejek eteryczny został wstępnie przetestowany na dorosłych osobnikach komarów Aedes aegypti w stężeniach 100 i 1000 ppm. Nanieść 2 ml każdego przygotowanego roztworu na liczbę Whatmana. 1 kawałek bibuły filtracyjnej (o wymiarach 12 x 15 cm2) i pozwolić acetonowi odparować przez 10 minut. Bibułę filtracyjną nasączoną jedynie 2 ml acetonu użyto jako kontrolę. Po odparowaniu acetonu, nasączoną bibułę filtracyjną i kontrolną umieszczono w cylindrycznej probówce (głębokość 10 cm). Dziesięć 3-4-dniowych komarów nieżywiących się krwią przeniesiono do trzech powtórzeń każdego stężenia. Na podstawie wyników wstępnych testów przetestowano różne stężenia wybranych olejków. Śmiertelność rejestrowano po 1 godzinie, 2 godzinach, 3 godzinach, 4 godzinach, 5 godzinach, 6 godzinach, 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach od uwolnienia komarów. Oblicz wartości LC50 dla czasu ekspozycji 24 godzin, 48 godzin i 72 godzin. Jeśli śmiertelność w grupie kontrolnej przekroczy 20%, powtórz cały test. Analogicznie, jeśli śmiertelność w grupie kontrolnej przekroczy 5%, skoryguj wyniki dla próbek poddanych działaniu środka, stosując wzór Abbotta68.
Do analizy związków składowych wybranych olejków eterycznych zastosowano chromatografię gazową (Agilent 7890A) i spektrometrię mas (Accu TOF GCv, Jeol). GC był wyposażony w detektor FID i kolumnę kapilarną (HP5-MS). Gazem nośnym był hel, a prędkość przepływu wynosiła 1 ml/min. Program GC ustala dla Allium sativum wartości 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M, a dla Ocimum Sainttum wartości 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5-280, dla mięty 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, dla eukaliptusa 20:60-1M-10-200-3M-30-280, a dla czerwieni. Dla tysiąca warstw wartości te wynoszą 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
Główne związki każdego olejku eterycznego zidentyfikowano na podstawie procentowej powierzchni obliczonej na podstawie wyników chromatogramu GC i spektrometrii masowej (w odniesieniu do bazy danych standardów NIST 70).
Dwa główne związki w każdym olejku eterycznym wybrano na podstawie wyników GC-MS i zakupiono od firmy Sigma-Aldrich o czystości 98–99% do dalszych biotestów. Związki przetestowano pod kątem skuteczności larwicydowej i działania na osobniki dorosłe komara Aedes aegypti, jak opisano powyżej. Najczęściej stosowane syntetyczne larwicydy, tamefosat (Sigma Aldrich) i lek dla osobników dorosłych malation (Sigma Aldrich), przeanalizowano w celu porównania ich skuteczności z wybranymi związkami olejku eterycznego, stosując tę samą procedurę.
Mieszaniny binarne wybranych związków terpenowych oraz związków terpenowych i komercyjnych związków fosforoorganicznych (tilefos i malation) przygotowano poprzez zmieszanie dawki LC50 każdego związku kandydującego w stosunku 1:1. Przygotowane kombinacje przetestowano na larwach i osobnikach dorosłych Aedes aegypti, jak opisano powyżej. Każdy biotest przeprowadzono trzykrotnie dla każdej kombinacji i trzykrotnie dla poszczególnych związków obecnych w każdej kombinacji. Śmierć owadów docelowych odnotowano po 24 godzinach. Oblicz oczekiwany wskaźnik śmiertelności dla mieszaniny binarnej, korzystając z poniższego wzoru.
gdzie E = oczekiwany współczynnik śmiertelności komarów Aedes aegypti w odpowiedzi na kombinację binarną, tj. połączenie (A + B).
Efekt każdej mieszaniny binarnej został określony jako synergistyczny, antagonistyczny lub brak efektu na podstawie wartości χ2 obliczonej metodą opisaną przez Pavlę52. Oblicz wartość χ2 dla każdej kombinacji, korzystając z poniższego wzoru.
Efekt kombinacji zdefiniowano jako synergistyczny, gdy obliczona wartość χ2 była większa od wartości z tabeli dla odpowiadających stopni swobody (95% przedział ufności) i jeśli zaobserwowana śmiertelność przekraczała oczekiwaną śmiertelność. Podobnie, jeśli obliczona wartość χ2 dla dowolnej kombinacji przekracza wartość z tabeli dla pewnych stopni swobody, ale zaobserwowana śmiertelność jest niższa od oczekiwanej śmiertelności, leczenie uznaje się za antagonistyczne. A jeśli w dowolnej kombinacji obliczona wartość χ2 jest mniejsza od wartości z tabeli dla odpowiadających stopni swobody, uznaje się, że kombinacja nie ma efektu.
Wybrano od trzech do czterech potencjalnie synergistycznych kombinacji (100 larw i 50 larwobójczych i dorosłych owadów) do testowania na dużej liczbie owadów. Dorosłe osobniki) postępować jak powyżej. Oprócz mieszanin, poszczególne związki obecne w wybranych mieszaninach testowano również na równej liczbie larw i dorosłych osobników Aedes aegypti. Stosunek kombinacji wynosi jedną część dawki LC50 jednego związku kandydującego i część dawki LC50 drugiego związku składowego. W bioteście aktywności dorosłych, wybrane związki rozpuszczono w rozpuszczalniku acetonowym i naniesiono na bibułę filtracyjną owiniętą w cylindryczny plastikowy pojemnik o pojemności 1300 cm3. Aceton odparowano przez 10 minut, a dorosłe osobniki uwolniono. Podobnie, w bioteście larwobójczym, dawki związków kandydujących LC50 najpierw rozpuszczono w równych objętościach DMSO, a następnie zmieszano z 1 litrem wody przechowywanej w plastikowych pojemnikach o pojemności 1300 cm3, po czym uwolniono larwy.
Do obliczenia wartości LC50 wykorzystano analizę probabilistyczną 71 zarejestrowanych danych dotyczących śmiertelności, wykorzystując oprogramowanie SPSS (wersja 16) i Minitab.
Czas publikacji: 01-07-2024