Aby skuteczniekontrolować komaryi zmniejszyć częstość występowania chorób, które przenoszą, potrzebne są strategiczne, zrównoważone i przyjazne dla środowiska alternatywy dla pestycydów chemicznych. Oceniliśmy mączki z nasion niektórych Brassicaceae (rodzina Brassica) jako źródło izotiocyjanianów pochodzenia roślinnego wytwarzanych w wyniku hydrolizy enzymatycznej biologicznie nieaktywnych glukozynolanów do stosowania w zwalczaniu egipskiego Aedes (L., 1762). Pięcioodtłuszczona mączka z nasion (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 i Thlaspi arvense – trzy główne typy inaktywacji termicznej i degradacji enzymatycznej. produkty Do określenia toksyczności (LC50) izotiocyjanianu allilu, izotiocyjanian benzylu i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanian na larwy Aedes aegypti przy 24-godzinnej ekspozycji = 0,04 g/120 ml dH2O). Wartości LC50 dla musztardy, gorczycy białej i skrzypu. mączka z nasion wynosiła odpowiednio 0,05, 0,08 i 0,05 w porównaniu z izotiocyjanianem allilu (LC50 = 19,35 ppm) i 4.-hydroksybenzyloizotiocyjanianem (LC50 = 55,41 ppm) był bardziej toksyczny dla larw przez 24 godziny po zabiegu niż odpowiednio 0,1 g/120 ml dH2O. Wyniki te są zgodne z produkcją mączki z nasion lucerny. Wyższa wydajność estrów benzylowych odpowiada obliczonym wartościom LC50. Stosowanie mączki z nasion może stanowić skuteczną metodę zwalczania komarów. skuteczność proszku z nasion krzyżowych i jego głównych składników chemicznych przeciwko larwom komarów i pokazuje, w jaki sposób naturalne związki zawarte w proszku z nasion krzyżowych mogą służyć jako obiecujący, przyjazny dla środowiska środek larwobójczy do zwalczania komarów.
Choroby przenoszone przez wektory wywoływane przez komary Aedes pozostają głównym globalnym problemem zdrowia publicznego. Częstość występowania chorób przenoszonych przez komary rozprzestrzenia się geograficznie1,2,3 i ponownie pojawia się, prowadząc do wybuchów poważnych chorób4,5,6,7. Rozprzestrzenianie się chorób wśród ludzi i zwierząt (np. chikungunya, dengi, gorączki Doliny Rift, żółtej febry i wirusa Zika) jest bezprecedensowe. Sama gorączka denga naraża na ryzyko zakażenia około 3,6 miliarda ludzi w tropikach, przy czym szacuje się, że rocznie dochodzi do 390 milionów infekcji, co powoduje 6 100–24 300 zgonów rocznie8. Ponowne pojawienie się i epidemia wirusa Zika w Ameryce Południowej przyciągnęła uwagę całego świata ze względu na uszkodzenia mózgu, jakie powoduje u dzieci urodzonych przez zakażone kobiety2. Kremer i wsp. 3 przewidują, że zasięg geograficzny komarów Aedes będzie nadal się zwiększał i że do 2050 r. połowa światowej populacji będzie narażona na ryzyko zakażenia arbowirusami przenoszonymi przez komary.
Z wyjątkiem niedawno opracowanych szczepionek przeciwko dendze i żółtej febrze, nie opracowano jeszcze szczepionek przeciwko większości chorób przenoszonych przez komary9,10,11. Szczepionki są nadal dostępne w ograniczonych ilościach i są stosowane wyłącznie w badaniach klinicznych. Zwalczanie wektorów komarów za pomocą syntetycznych środków owadobójczych jest kluczową strategią kontroli rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez komary12,13. Chociaż syntetyczne pestycydy są skuteczne w zabijaniu komarów, ciągłe stosowanie syntetycznych pestycydów negatywnie wpływa na organizmy inne niż docelowe i zanieczyszcza środowisko14,15,16. Jeszcze bardziej niepokojąca jest tendencja wzrostu odporności komarów na chemiczne środki owadobójcze17,18,19. Problemy związane z pestycydami przyspieszyły poszukiwania skutecznych i przyjaznych dla środowiska alternatyw w celu zwalczania wektorów chorób.
Opracowano różne rośliny jako źródła fitopestycydów do zwalczania szkodników20,21. Substancje roślinne są na ogół przyjazne dla środowiska, ponieważ ulegają biodegradacji i mają niską lub znikomą toksyczność dla organizmów niebędących przedmiotem zwalczania, takich jak ssaki, ryby i płazy20,22. Wiadomo, że preparaty ziołowe wytwarzają różnorodne związki bioaktywne o różnych mechanizmach działania, aby skutecznie kontrolować różne etapy życia komarów23,24,25,26. Związki pochodzenia roślinnego, takie jak olejki eteryczne i inne aktywne składniki roślinne, wzbudziły zainteresowanie i utorowały drogę innowacyjnym narzędziom do zwalczania wektorów komarów. Olejki eteryczne, monoterpeny i seskwiterpeny działają jako repelenty, środki odstraszające żerowanie i owicydy27,28,29,30,31,32,33. Wiele olejów roślinnych powoduje śmierć larw, poczwarek i dorosłych komarów34,35,36, wpływając na układ nerwowy, oddechowy, hormonalny i inne ważne owady37.
Ostatnie badania dostarczyły wiedzy na temat potencjalnego wykorzystania gorczycy i jej nasion jako źródła związków bioaktywnych. Mączkę z nasion gorczycy przetestowano jako biofumigant38,39,40,41 i zastosowano ją jako dodatek do gleby w celu zwalczania chwastów42,43,44 i zwalczania patogenów roślinnych przenoszonych przez glebę45,46,47,48,49,50 oraz odżywiania roślin. nicienie 41,51, 52, 53, 54 i szkodniki 55, 56, 57, 58, 59, 60. Działanie grzybobójcze tych proszków nasion przypisuje się związkom ochrony roślin zwanym izotiocyjanianami38,42,60. W roślinach te związki ochronne są magazynowane w komórkach roślinnych w postaci niebioaktywnych glukozynolanów. Jednakże, gdy rośliny zostaną uszkodzone przez żerowanie owadów lub infekcję patogenami, glukozynolany są hydrolizowane przez mirozynazę do bioaktywnych izotiocyjanianów55,61. Izotiocyjaniany to lotne związki, o których wiadomo, że mają szerokie spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego i owadobójczego, a ich struktura, aktywność biologiczna i zawartość różnią się znacznie w przypadku gatunków Brassicaceae42,59,62,63.
Chociaż wiadomo, że izotiocyjaniany pochodzące z mączki z nasion gorczycy mają działanie owadobójcze, brakuje danych na temat aktywności biologicznej przeciwko ważnym z medycznego punktu widzenia wektorom stawonogów. W naszym badaniu zbadaliśmy działanie larwobójcze czterech odtłuszczonych proszków nasion na komary Aedes. Larwy Aedes aegypti. Celem badania była ocena ich potencjalnego zastosowania jako przyjaznych dla środowiska biopestycydów do zwalczania komarów. Zbadano także trzy główne składniki chemiczne mączki z nasion, izotiocyjanian allilu (AITC), izotiocyjanian benzylu (BITC) i tiocyjanian 4-hydroksybenzylu (4-HBITC), aby sprawdzić aktywność biologiczną tych składników chemicznych na larwach komarów. Jest to pierwszy raport oceniający skuteczność czterech proszków z nasion kapusty i ich głównych składników chemicznych przeciwko larwom komarów.
Kolonie laboratoryjne Aedes aegypti (szczep Rockefeller) utrzymywano w temperaturze 26°C, przy wilgotności względnej 70% (RH) i czasie 10:14 godzin (fotoperiod L:D). Skojarzone samice trzymano w plastikowych klatkach (wysokość 11 cm i średnica 9,5 cm) i karmiono butelką przy użyciu cytrynianowanej krwi bydlęcej (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, Kalifornia, USA). Podawanie krwi przeprowadzono jak zwykle przy użyciu membranowego podajnika wieloszklanego (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) podłączonego do rurki z łaźnią z wodą obiegową (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) o temperaturze kontrola 37°C. Rozciągnij folię Parafilm M na dnie każdej szklanej komory zasilającej (powierzchnia 154 mm2). Następnie każdy karmnik umieszczono na górnej siatce przykrywającej klatkę zawierającą samicę. Około 350–400 µl krwi bydlęcej dodano do szklanego lejka do karmienia za pomocą pipety Pasteura (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i dorosłe robaki pozostawiono do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę. Następnie ciężarnym samicom podano 10% roztwór sacharozy i pozwolono im składać jaja na wilgotnej bibule filtracyjnej wyłożonej pojedynczymi ultraprzezroczystymi miseczkami do sufletu (rozmiar 1,25 uncji, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). klatka z wodą. Umieść bibułę filtracyjną zawierającą jaja w zamkniętej torbie (SC Johnsons, Racine, WI) i przechowuj w temperaturze 26°C. Z jaj wykluły się i około 200–250 larw hodowano na plastikowych tacach zawierających mieszaninę karmy dla królików (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) i sproszkowanej wątroby (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA). i filet rybny (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Niemcy) w proporcji 2:1:1. W naszych testach biologicznych wykorzystano larwy w późnym trzecim stadium rozwojowym.
Materiał siewny roślin użyty w tym badaniu uzyskano z następujących źródeł komercyjnych i rządowych: Brassica juncea (gorczyca brązowa – Pacific Gold) i Brassica juncea (gorczyca biała – Ida Gold) od Pacific Northwest Farmers' Cooperative, Washington State, USA; (Garden Cress) z Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, USA i Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) z USDA-ARS, Peoria, IL, USA; Żadne z nasion użytych do badań nie było zaprawiane pestycydami. Cały materiał siewny został przetworzony i użyty w tym badaniu zgodnie z przepisami lokalnymi i krajowymi oraz zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi przepisami lokalnymi i krajowymi. W badaniu tym nie badano odmian roślin transgenicznych.
Nasiona Brassica juncea (PG), lucerny (Ls), gorczycy białej (IG), Thlaspi arvense (DFP) zmielono na drobny proszek za pomocą młyna ultraodśrodkowego Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Niemcy) wyposażonego w oczko 0,75 mm i stali nierdzewnej wirnik stalowy, 12 zębów, 10 000 obr/min (tab. 1). Zmielony proszek z nasion przeniesiono na bibułkę i odtłuszczono heksanem w aparacie Soxhleta przez 24 godziny. Podpróbkę odtłuszczonej musztardy polnej poddano obróbce cieplnej w temperaturze 100 ° C przez 1 godzinę w celu denaturacji mirozynazy i zapobieżenia hydrolizie glukozynolanów z utworzeniem biologicznie aktywnych izotiocyjanianów. Jako kontrolę negatywną zastosowano proszek z nasion skrzypu polnego poddany obróbce cieplnej (DFP-HT) poprzez denaturację mirozynazy.
Zawartość glukozynolanów w odtłuszczonej mączce z nasion oznaczono trzykrotnie przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem 64 . W skrócie, 3 ml metanolu dodano do 250 mg próbki odtłuszczonego proszku z nasion. Każdą próbkę poddano sonikacji w łaźni wodnej przez 30 minut i pozostawiono w ciemności w temperaturze 23°C na 16 godzin. Następnie 1 ml porcję warstwy organicznej przesączono przez filtr 0,45 µm do automatycznego podajnika próbek. W oparciu o system Shimadzu HPLC (dwie pompy LC 20AD, autosampler SIL 20A, odgazowywacz DGU 20As, detektor SPD-20A UV-VIS do monitorowania przy 237 nm oraz moduł magistrali komunikacyjnej CBM-20A) oznaczono zawartość glukozynolanów w mączce siewnej w trzech egzemplarzach. przy użyciu oprogramowania Shimadzu LC Solution w wersji 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). Kolumną była kolumna z odwróconą fazą C18 Inertsil (250 mm x 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, Kalifornia, USA). Początkowe warunki fazy ruchomej ustawiono na 12% metanol/88% 0,01 M wodorotlenek tetrabutyloamoniowy w wodzie (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) przy szybkości przepływu 1 ml/min. Po wstrzyknięciu 15 µl próbki warunki początkowe utrzymywano przez 20 minut, po czym doprowadzono proporcję rozpuszczalnika do 100% metanolu, przy całkowitym czasie analizy próbki wynoszącym 65 minut. Krzywą standardową (w oparciu o nM/mAb) wygenerowano przez seryjne rozcieńczenia świeżo przygotowanych standardów synapiny, glukozynolanu i mirozyny (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) w celu oszacowania zawartości siarki w odtłuszczonej mączce z nasion. glukozynolany. Stężenia glukozynolanów w próbkach badano na urządzeniu Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, USA) przy użyciu wersji OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) wyposażonej w tę samą kolumnę i stosując wcześniej opisaną metodę. Oznaczono stężenia glukozynolanów; być porównywalne pomiędzy systemami HPLC.
Izotiocyjanian allilu (94%, trwały) i izotiocyjanian benzylu (98%) zakupiono od Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Izotiocyjanian 4-hydroksybenzylu zakupiono od ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, Kalifornia, USA). Po enzymatycznej hydrolizie przez mirozynazę, glukozynolany, glukozynolany i glukozynolany tworzą odpowiednio izotiocyjanian allilu, izotiocyjanian benzylu i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanian.
Laboratoryjne testy biologiczne wykonano według metody Muturi i in. 32 z modyfikacjami. W badaniach wykorzystano pięć niskotłuszczowych nawozów do nasion: DFP, DFP-HT, IG, PG i Ls. Dwadzieścia larw umieszczono w jednorazowej zlewce trójdrożnej o pojemności 400 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) zawierającej 120 ml wody dejonizowanej (dH2O). Zbadano siedem stężeń mączki z nasion pod kątem toksyczności larw komarów: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 i 0,12 g mączki z nasion/120 ml dH2O dla mączki z nasion DFP, DFP-HT, IG i PG. Wstępne testy biologiczne wskazują, że odtłuszczona mąka z nasion Ls jest bardziej toksyczna niż cztery inne badane mąki z nasion. Dlatego dostosowaliśmy siedem stężeń mączki z nasion Ls do zabiegu do następujących stężeń: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 i 0,075 g/120 ml dH2O.
Nietraktowaną grupę kontrolną (dH2O, bez dodatku mączki z nasion) włączono w celu oceny normalnej śmiertelności owadów w warunkach testowych. Biotesty toksykologiczne dla każdej mączki z nasion obejmowały trzy repliki zlewek o trzech nachyleniach (20 larw w późnym trzecim stadium rozwoju na zlewkę), co dało w sumie 108 fiolek. Pojemniki potraktowane przechowywano w temperaturze pokojowej (20-21°C) i rejestrowano śmiertelność larw w ciągu 24 i 72 godzin ciągłej ekspozycji na stężenia stosowane podczas zabiegu. Jeśli ciało komara i jego przydatki nie poruszają się po przekłuciu lub dotknięciu cienką szpatułką ze stali nierdzewnej, larwy komara uważa się za martwe. Martwe larwy zwykle pozostają nieruchome w pozycji grzbietowej lub brzusznej na dnie pojemnika lub na powierzchni wody. Doświadczenie powtórzono trzykrotnie w różne dni, stosując różne grupy larw, w sumie 180 larw poddano działaniu każdego stężenia preparatu.
Toksyczność AITC, BITC i 4-HBITC dla larw komarów oceniano przy użyciu tej samej procedury testu biologicznego, ale z różnymi metodami leczenia. Przygotuj roztwory podstawowe o stężeniu 100 000 ppm dla każdej substancji chemicznej, dodając 100 µl substancji chemicznej do 900 µl absolutnego etanolu w 2-ml probówce wirówkowej i wytrząsając przez 30 sekund w celu dokładnego wymieszania. Stężenia lecznicze określono na podstawie naszych wstępnych testów biologicznych, które wykazały, że BITC jest znacznie bardziej toksyczny niż AITC i 4-HBITC. Do określenia toksyczności stosuje się 5 stężeń BITC (1, 3, 6, 9 i 12 ppm), 7 stężeń AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm) oraz 6 stężeń 4-HBITC (15 , 15, 20, 25, 30 i 35 ppm). 30, 45, 60, 75 i 90 ppm). Do grupy kontrolnej wstrzyknięto 108 µl absolutnego etanolu, co odpowiada maksymalnej objętości obróbki chemicznej. Testy biologiczne powtórzono jak powyżej, eksponując łącznie 180 larw na każde stężenie terapeutyczne. Śmiertelność larw rejestrowano dla każdego stężenia AITC, BITC i 4-HBITC po 24 godzinach ciągłej ekspozycji.
Analizę probitową 65 danych dotyczących śmiertelności zależnej od dawki przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Polo (Polo Plus, LeOra Software, wersja 1.0) w celu obliczenia 50% stężenia śmiertelnego (LC50), 90% stężenia śmiertelnego (LC90), nachylenia, współczynnika dawki śmiertelnej i 95 % śmiertelnego stężenia. w oparciu o przedziały ufności dla stosunków dawek śmiertelnych dla stężenia przekształconego logarytmicznie i krzywych dawka-śmiertelność. Dane dotyczące śmiertelności opierają się na połączonych powtórzeniach danych dotyczących 180 larw narażonych na działanie każdego stężenia leczniczego. Analizy probabilistyczne przeprowadzono oddzielnie dla każdej mączki nasiennej i każdego składnika chemicznego. Na podstawie 95% przedziału ufności stosunku dawki śmiertelnej uznano, że toksyczność mączki nasiennej i składników chemicznych dla larw komarów jest znacząco różna, zatem przedział ufności zawierający wartość 1 nie różnił się istotnie, P = 0,0566.
Wyniki HPLC oznaczania głównych glukozynolanów w odtłuszczonych mąkach z nasion DFP, IG, PG i Ls zestawiono w Tabeli 1. Główne glukozynolany w badanych mąkach z nasion były różne, z wyjątkiem DFP i PG, które zawierały glukozynolany mirozynazy. Zawartość mirozyniny w PG była wyższa niż w DFP i wynosiła odpowiednio 33,3 ± 1,5 i 26,5 ± 0,9 mg/g. Proszek z nasion Ls zawierał 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikonu, natomiast proszek z nasion IG zawierał 38,0 ± 0,5 mg/g synapiny.
Larwy Ae. Komary Aedes aegypti ginęły po zastosowaniu odtłuszczonej mączki z nasion, chociaż skuteczność zabiegu różniła się w zależności od gatunku rośliny. Jedynie DFP-NT nie był toksyczny dla larw komarów po 24 i 72 godzinach ekspozycji (tab. 2). Toksyczność aktywnego proszku nasion wzrastała wraz ze wzrostem stężenia (ryc. 1A, B). Toksyczność mączki nasion dla larw komarów różniła się znacząco w oparciu o 95% CI stosunku dawki śmiertelnej wartości LC50 w ocenach 24-godzinnych i 72-godzinnych (Tabela 3). Po 24 godzinach działanie toksyczne mączki z nasion Ls było większe niż w przypadku innych zabiegów mączką z nasion, przy najwyższej aktywności i maksymalnej toksyczności dla larw (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larwy były mniej wrażliwe na DFP po 24 godzinach w porównaniu z zaprawianiem proszkiem nasion IG, Ls i PG, przy wartościach LC50 wynoszących odpowiednio 0,115, 0,04 i 0,08 g/120 ml dH2O, które były statystycznie wyższe niż wartość LC50. 0,211 g/120 ml dH2O (Tabela 3). Wartości LC90 dla DFP, IG, PG i Ls wynosiły odpowiednio 0,376, 0,275, 0,137 i 0,074 g/120 ml dH2O (Tabela 2). Najwyższe stężenie DPP wynosiło 0,12 g/120 ml dH2O. Po 24 godzinach oceny średnia śmiertelność larw wyniosła zaledwie 12%, podczas gdy średnia śmiertelność larw IG i PG wyniosła odpowiednio 51% i 82%. Po 24 godzinach oceny średnia śmiertelność larw dla najwyższego stężenia mączki z nasion Ls (0,075 g/120 ml dH2O) wyniosła 99% (ryc. 1A).
Krzywe śmiertelności oszacowano na podstawie reakcji na dawkę (Probit) Ae. Larwy egipskie (larwy w trzecim stadium larwalnym) do stężenia mączki siewnej po 24 godzinach (A) i 72 godzinach (B) po zabiegu. Linia przerywana przedstawia LC50 zaprawiania mączką nasienną. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense inaktywowany termicznie, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
W ocenie 72-godzinnej wartości LC50 mączki z nasion DFP, IG i PG wynosiły odpowiednio 0,111, 0,085 i 0,051 g/120 ml dH2O. Prawie wszystkie larwy narażone na mączkę z nasion Ls zdechły po 72 godzinach ekspozycji, więc dane dotyczące śmiertelności były niezgodne z analizą Probit. W porównaniu do innych mączek nasiennych larwy były mniej wrażliwe na traktowanie mączką DFP i charakteryzowały się statystycznie wyższymi wartościami LC50 (tab. 2 i 3). Po 72 godzinach wartości LC50 dla zaprawiania mączką nasienną DFP, IG i PG oszacowano na odpowiednio 0,111, 0,085 i 0,05 g/120 ml dH2O. Po 72 godzinach oceny wartości LC90 proszków nasion DFP, IG i PG wynosiły odpowiednio 0,215, 0,254 i 0,138 g/120 ml dH2O. Po 72 godzinach oceny średnia śmiertelność larw w przypadku zaprawiania mączką nasienną DFP, IG i PG przy maksymalnym stężeniu 0,12 g/120 ml dH2O wyniosła odpowiednio 58%, 66% i 96% (ryc. 1B). Po 72-godzinnej ocenie stwierdzono, że mączka z nasion PG jest bardziej toksyczna niż mączka z nasion IG i DFP.
Syntetyczne izotiocyjaniany, izotiocyjanian allilu (AITC), izotiocyjanian benzylu (BITC) i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanian (4-HBITC) mogą skutecznie zabijać larwy komarów. W 24 godziny po zabiegu BITC był bardziej toksyczny dla larw przy wartości LC50 wynoszącej 5,29 ppm w porównaniu z 19,35 ppm dla AITC i 55,41 ppm dla 4-HBITC (Tabela 4). W porównaniu do AITC i BITC, 4-HBITC ma niższą toksyczność i wyższą wartość LC50. Istnieją znaczące różnice w toksyczności larw komarów dwóch głównych izotiocyjanianów (Ls i PG) w najsilniejszej mączce z nasion. Toksyczność oparta na stosunku dawki śmiertelnej wartości LC50 pomiędzy AITC, BITC i 4-HBITC wykazała statystyczną różnicę taką, że 95% CI stosunku dawki śmiertelnej LC50 nie obejmowało wartości 1 (P = 0,05, tabela 4). Oszacowano, że najwyższe stężenia zarówno BITC, jak i AITC powodują śmierć 100% badanych larw (Rysunek 2).
Krzywe śmiertelności oszacowano na podstawie reakcji na dawkę (Probit) Ae. 24 godziny po zabiegu larwy egipskie (larwy w trzecim stadium rozwojowym) osiągnęły stężenie syntetycznego izotiocyjanianu. Linia przerywana przedstawia LC50 dla obróbki izotiocyjanianem. Izotiocyjanian benzylu BITC, izotiocyjanian allilu AITC i 4-HBITC.
Od dawna badano zastosowanie biopestycydów roślinnych jako środków do zwalczania wektorów komarów. Wiele roślin wytwarza naturalne substancje chemiczne o działaniu owadobójczym37. Zawarte w nich bioaktywne związki stanowią atrakcyjną alternatywę dla syntetycznych środków owadobójczych o ogromnym potencjale zwalczania szkodników, w tym komarów.
Gorczycę uprawia się w celu uzyskania nasion, wykorzystywanych jako przyprawa i źródło oleju. W przypadku ekstrakcji oleju musztardowego z nasion lub w przypadku ekstrakcji musztardy w celu wykorzystania jako biopaliwo 69 produktem ubocznym jest odtłuszczona mączka z nasion. Ta mączka z nasion zachowuje wiele naturalnych składników biochemicznych i enzymów hydrolitycznych. Toksyczność tej mączki z nasion przypisuje się wytwarzaniu izotiocyjanianów55,60,61. Izotiocyjaniany powstają w wyniku hydrolizy glukozynolanów przez enzym mirozynazę podczas uwadniania mączki nasion38,55,70 i wiadomo, że mają działanie grzybobójcze, bakteriobójcze, nicieniobójcze i owadobójcze, a także inne właściwości, w tym chemiczne działanie sensoryczne i właściwości chemioterapeutyczne61,62, 70. Kilka badań wykazało, że gorczyca i mączka z nasion działają skutecznie jako fumiganty przeciwko szkodnikom glebowym i przechowywanym w żywności57,59,71,72. W tym badaniu oceniliśmy toksyczność mączki czteronasionowej i jej trzech bioaktywnych produktów AITC, BITC i 4-HBITC dla larw komarów Aedes. Aedes aegypti. Oczekuje się, że dodanie mączki z nasion bezpośrednio do wody zawierającej larwy komarów aktywuje procesy enzymatyczne, w wyniku których powstają izotiocyjaniany toksyczne dla larw komarów. Tę biotransformację wykazano częściowo poprzez zaobserwowane działanie larwobójcze mączki z nasion i utratę aktywności owadobójczej, gdy mączkę z nasion gorczycy karłowatej poddano obróbce cieplnej przed użyciem. Oczekuje się, że obróbka cieplna zniszczy enzymy hydrolityczne aktywujące glukozynolany, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się bioaktywnych izotiocyjanianów. Jest to pierwsze badanie potwierdzające właściwości owadobójcze proszku z nasion kapusty przeciwko komarom w środowisku wodnym.
Spośród badanych proszków z nasion najbardziej toksyczny był proszek z nasion rzeżuchy wodnej (Ls), powodujący wysoką śmiertelność Aedes albopictus. Larwy Aedes aegypti poddano obróbce w sposób ciągły przez 24 godziny. Pozostałe trzy proszki z nasion (PG, IG i DFP) wykazywały wolniejszą aktywność i nadal powodowały znaczną śmiertelność po 72 godzinach ciągłego traktowania. Tylko mączka z nasion Ls zawierała znaczne ilości glukozynolanów, podczas gdy PG i DFP zawierały mirozynazę, a IG zawierał glukozynolan jako główny glukozynolan (Tabela 1). Glukotropaeolina ulega hydrolizie do BITC, a sinalbina ulega hydrolizie do 4-HBITC61,62. Wyniki naszych testów biologicznych wskazują, że zarówno mączka z nasion Ls, jak i syntetyczny BITC są wysoce toksyczne dla larw komarów. Głównym składnikiem mączki z nasion PG i DFP jest glukozynolan mirozynazy, który ulega hydrolizie do AITC. AITC skutecznie zabija larwy komarów przy wartości LC50 wynoszącej 19,35 ppm. W porównaniu do AITC i BITC, izotiocyjanian 4-HBITC jest najmniej toksyczny dla larw. Chociaż AITC jest mniej toksyczny niż BITC, ich wartości LC50 są niższe niż w przypadku wielu olejków eterycznych testowanych na larwach komarów32,73,74,75.
Nasz proszek z nasion krzyżowych do stosowania przeciwko larwom komarów zawiera jeden główny glukozynolan, stanowiący ponad 98-99% całkowitej glukozynolanów, jak określono metodą HPLC. Wykryto śladowe ilości innych glukozynolanów, ale ich poziomy były mniejsze niż 0,3% wszystkich glukozynolanów. Proszek z nasion rzeżuchy wodnej (L. sativum) zawiera wtórne glukozynolany (sinigrin), ale ich udział wynosi 1% ogółu glukozynolanów, a ich zawartość jest nadal niewielka (około 0,4 mg/g proszku z nasion). Chociaż PG i DFP zawierają ten sam główny glukozynolan (mirozynę), działanie larwobójcze ich mączek nasiennych różni się znacząco ze względu na ich wartości LC50. Różni się toksycznością dla mączniaka prawdziwego. Pojawienie się larw Aedes aegypti może wynikać z różnic w aktywności mirozynazy lub stabilności pomiędzy dwoma materiałami siewnymi. Aktywność mirozynazy odgrywa ważną rolę w biodostępności produktów hydrolizy, takich jak izotiocyjaniany, w roślinach Brassicaceae76. Poprzednie raporty Pococka i wsp.77 oraz Wilkinsona i wsp.78 wykazały, że zmiany w aktywności i stabilności mirozynazy mogą być również powiązane z czynnikami genetycznymi i środowiskowymi.
Oczekiwaną zawartość bioaktywnego izotiocyjanianu obliczono na podstawie wartości LC50 każdej mączki z nasion po 24 i 72 godzinach (Tabela 5) w celu porównania z odpowiednimi zastosowaniami chemicznymi. Po 24 godzinach izotiocyjaniany w mączce z nasion były bardziej toksyczne niż czyste związki. Wartości LC50 obliczone na podstawie części na milion (ppm) zaprawiania nasion izotiocyjanianami były niższe niż wartości LC50 dla zastosowań BITC, AITC i 4-HBITC. Zaobserwowaliśmy larwy zjadające granulki mączki nasiennej (Rysunek 3A). W rezultacie larwy mogą być narażone na bardziej skoncentrowaną ekspozycję na toksyczne izotiocyjaniany poprzez spożycie granulatu mączki nasiennej. Było to najbardziej widoczne w przypadku zaprawiania mączką nasion IG i PG przy 24-godzinnej ekspozycji, gdzie stężenia LC50 były odpowiednio o 75% i 72% niższe niż w przypadku zaprawiania czystym AITC i 4-HBITC. Zabiegi Ls i DFP były bardziej toksyczne niż czysty izotiocyjanian, przy wartościach LC50 odpowiednio o 24% i 41% niższych. Larwy poddane zabiegowi kontrolnemu pomyślnie przepoczwarzyły się (ryc. 3B), podczas gdy większość larw poddanych zabiegowi mączki nasiennej nie przepoczwarzyło się, a rozwój larw był znacznie opóźniony (ryc. 3B, D). U Spodopteralitura izotiocyjaniany są powiązane z opóźnieniem wzrostu i opóźnieniem rozwoju79.
Larwy Ae. Komary Aedes aegypti były stale narażone na działanie proszku z nasion Brassica przez 24–72 godziny. (A) Martwe larwy z cząstkami mączki nasiennej w narządach gębowych (zakreślone); (B) Zabieg kontrolny (dH20 bez dodatku mączki z nasion) pokazuje, że larwy rosną normalnie i zaczynają się przepoczwarzać po 72 godzinach (C, D) Larwy traktowane mączką z nasion; mączka z nasion wykazywała różnice w rozwoju i nie przepoczwarzała się.
Nie badaliśmy mechanizmu toksycznego działania izotiocyjanianów na larwy komarów. Jednakże wcześniejsze badania na mrówkach ognistych (Solenopsis invicta) wykazały, że hamowanie S-transferazy glutationowej (GST) i esterazy (EST) jest głównym mechanizmem bioaktywności izotiocyjanianów, a AITC, nawet przy niskiej aktywności, może również hamować aktywność GST . czerwone importowane mrówki ogniste w niskich stężeniach. Dawka wynosi 0,5 µg/ml80. Natomiast AITC hamuje acetylocholinoesterazę u dorosłych ryjkowców kukurydzianych (Sitophilus zeamais)81. Należy przeprowadzić podobne badania, aby wyjaśnić mechanizm działania izotiocyjanianów u larw komarów.
Stosujemy obróbkę DFP inaktywowaną ciepłem, aby poprzeć propozycję, że hydroliza glukozynolanów roślinnych do postaci reaktywnych izotiocyjanianów służy jako mechanizm zwalczania larw komarów za pomocą mączki z nasion gorczycy. Mączka nasienna DFP-HT nie była toksyczna przy badanych dawkach. Lafarga i in. 82 podali, że glukozynolany są wrażliwe na degradację w wysokich temperaturach. Oczekuje się również, że obróbka cieplna spowoduje denaturację enzymu mirozynazy w mączce z nasion i zapobiegnie hydrolizie glukozynolanów z utworzeniem reaktywnych izotiocyjanianów. Potwierdzili to również Okunade i in. 75 wykazało, że mirozynaza jest wrażliwa na temperaturę, wykazując, że aktywność mirozynazy została całkowicie inaktywowana, gdy nasiona gorczycy, gorczycy czarnej i krwistego korzenia wystawiono na działanie temperatur powyżej 80°. C. Mechanizmy te mogą powodować utratę aktywności owadobójczej mączki z nasion DFP poddanej obróbce cieplnej.
Zatem mączka z nasion gorczycy i jej trzy główne izotiocyjaniany są toksyczne dla larw komarów. Biorąc pod uwagę te różnice między mączką nasienną a zabiegami chemicznymi, stosowanie mączki nasiennej może być skuteczną metodą zwalczania komarów. Istnieje potrzeba zidentyfikowania odpowiednich preparatów i skutecznych systemów dostarczania, aby poprawić skuteczność i stabilność stosowania proszków nasion. Nasze wyniki wskazują na potencjalne zastosowanie mączki z nasion gorczycy jako alternatywy dla syntetycznych pestycydów. Technologia ta może stać się innowacyjnym narzędziem do zwalczania wektorów komarów. Ponieważ larwy komarów rozwijają się w środowisku wodnym, a glukozynolany mączki z nasion są enzymatycznie przekształcane w aktywne izotiocyjaniany po uwodnieniu, zastosowanie mączki z nasion gorczycy w wodzie pełnej komarów zapewnia znaczny potencjał zwalczania. Chociaż aktywność larwobójcza izotiocyjanianów jest różna (BITC > AITC > 4-HBITC), potrzebne są dalsze badania w celu ustalenia, czy połączenie mączki nasion z wieloma glukozynolanami synergistycznie zwiększa toksyczność. Jest to pierwsze badanie wykazujące owadobójcze działanie odtłuszczonej mączki z nasion roślin krzyżowych i trzech bioaktywnych izotiocyjanianów na komary. Wyniki tego badania wyznaczają nowe horyzonty, pokazując, że odtłuszczona mączka z nasion kapusty, produkt uboczny ekstrakcji oleju z nasion, może służyć jako obiecujący środek larwobójczy do zwalczania komarów. Informacje te mogą pomóc w dalszym odkrywaniu środków biokontroli roślin i opracowywaniu ich jako tanich, praktycznych i przyjaznych dla środowiska biopestycydów.
Zbiory danych wygenerowane na potrzeby tego badania i wynikające z nich analizy są dostępne u odpowiedniego autora na uzasadnione żądanie. Na koniec badania wszystkie materiały użyte w badaniu (owady i mączka z nasion) zostały zniszczone.
Czas publikacji: 29 lipca 2024 r