Skuteczniekontrola komarówi zmniejszyć występowanie chorób, które przenoszą, potrzebne są strategiczne, zrównoważone i przyjazne dla środowiska alternatywy dla pestycydów chemicznych. Oceniliśmy mączki nasienne z niektórych Brassicaceae (rodzina Brassica) jako źródło izotiocyjanianów pochodzenia roślinnego wytwarzanych przez enzymatyczną hydrolizę biologicznie nieaktywnych glukozynolanów do stosowania w zwalczaniu egipskich Aedes (L., 1762). Pięcioskładnikowa mączka z nasion odtłuszczonych (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 i Thlaspi arvense – trzy główne typy inaktywacji termicznej i degradacji enzymatycznej Produkty chemiczne Określenie toksyczności (LC50) izotiocyjanianu allilu, izotiocyjanianu benzylu i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanianu dla larw Aedes aegypti przy ekspozycji 24-godzinnej = 0,04 g/120 ml dH2O). Wartości LC50 dla gorczycy, gorczycy białej i skrzypu polnego. mączka z nasion wynosiła odpowiednio 0,05, 0,08 i 0,05 w porównaniu do izotiocyjanianu allilu (LC50 = 19,35 ppm), a 4. -Hydroksybenzyloizotiocyjanian (LC50 = 55,41 ppm) był bardziej toksyczny dla larw w ciągu 24 godzin po zabiegu niż 0,1 g/120 ml dH2O. Wyniki te są zgodne z produkcją mączki z nasion lucerny. Wyższa wydajność estrów benzylowych odpowiada obliczonym wartościom LC50. Stosowanie mączki z nasion może zapewnić skuteczną metodę zwalczania komarów. skuteczność proszku z nasion roślin krzyżowych i jego głównych składników chemicznych przeciwko larwom komarów i pokazuje, w jaki sposób naturalne związki w proszku z nasion roślin krzyżowych mogą służyć jako obiecujący przyjazny dla środowiska larwicyd do zwalczania komarów.
Choroby przenoszone przez wektory wywoływane przez komary Aedes pozostają poważnym globalnym problemem zdrowia publicznego. Częstość występowania chorób przenoszonych przez komary rozprzestrzenia się geograficznie1,2,3 i pojawia się ponownie, prowadząc do wybuchów ciężkich chorób4,5,6,7. Rozprzestrzenianie się chorób wśród ludzi i zwierząt (np. gorączka chikungunya, denga, gorączka doliny Rift, żółta febra i wirus Zika) jest bezprecedensowe. Sama gorączka denga naraża około 3,6 miliarda ludzi na ryzyko zakażenia w tropikach, przy czym szacuje się, że rocznie występuje 390 milionów zakażeń, co powoduje 6100–24 300 zgonów rocznie8. Ponowne pojawienie się i wybuch wirusa Zika w Ameryce Południowej przyciągnęło uwagę całego świata ze względu na uszkodzenie mózgu, jakie powoduje u dzieci urodzonych przez zakażone kobiety2. Kremer i in. 3 przewidują, że zasięg geograficzny komarów Aedes będzie się nadal rozszerzał i że do 2050 roku połowa populacji świata będzie narażona na zakażenie arbowirusami przenoszonymi przez komary.
Z wyjątkiem niedawno opracowanych szczepionek przeciwko dendze i żółtej febrze, szczepionki przeciwko większości chorób przenoszonych przez komary nie zostały jeszcze opracowane9,10,11. Szczepionki są nadal dostępne w ograniczonych ilościach i są stosowane wyłącznie w badaniach klinicznych. Kontrola komarów przenoszących choroby za pomocą syntetycznych insektycydów jest kluczową strategią kontroli rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez komary12,13. Chociaż syntetyczne pestycydy są skuteczne w zabijaniu komarów, ciągłe stosowanie syntetycznych pestycydów negatywnie wpływa na organizmy niebędące celem i zanieczyszcza środowisko14,15,16. Jeszcze bardziej alarmujący jest trend wzrostu odporności komarów na chemiczne insektycydy17,18,19. Te problemy związane z pestycydami przyspieszyły poszukiwania skutecznych i przyjaznych dla środowiska alternatyw w celu kontrolowania wektorów chorób.
Różne rośliny zostały opracowane jako źródła fitopestycydów do zwalczania szkodników20,21. Substancje roślinne są na ogół przyjazne dla środowiska, ponieważ są biodegradowalne i mają niską lub znikomą toksyczność dla organizmów niebędących celem, takich jak ssaki, ryby i płazy20,22. Wiadomo, że preparaty ziołowe wytwarzają różnorodne związki bioaktywne o różnych mechanizmach działania, aby skutecznie kontrolować różne stadia życia komarów23,24,25,26. Związki pochodzenia roślinnego, takie jak olejki eteryczne i inne aktywne składniki roślinne, zyskały uwagę i utorowały drogę innowacyjnym narzędziom do zwalczania komarów przenoszących szkodniki. Olejki eteryczne, monoterpeny i seskwiterpeny działają jako repelenty, odstraszacze pokarmowe i owicydy27,28,29,30,31,32,33. Wiele olejów roślinnych powoduje śmierć larw, poczwarek i osobników dorosłych komarów34,35,36, wpływając na układ nerwowy, oddechowy, hormonalny i inne ważne układy owadów37.
Ostatnie badania dostarczyły wglądu w potencjalne zastosowanie roślin gorczycy i ich nasion jako źródła związków bioaktywnych. Mączka z nasion gorczycy została przetestowana jako biofumigant38,39,40,41 i była stosowana jako dodatek do gleby w celu tłumienia chwastów42,43,44 i kontroli patogenów roślinnych przenoszonych przez glebę45,46,47,48,49,50, odżywiania roślin. nicienie 41,51, 52, 53, 54 i szkodniki 55, 56, 57, 58, 59, 60. Aktywność grzybobójcza tych proszków nasion jest przypisywana związkom ochronnym roślin zwanym izotiocyjanianami38,42,60. W roślinach te związki ochronne są magazynowane w komórkach roślinnych w postaci niebioaktywnych glukozynolanów. Jednakże, gdy rośliny zostaną uszkodzone przez żerowanie owadów lub infekcję patogenami, glukozynolany są hydrolizowane przez mirozynazę do bioaktywnych izotiocyjanianów55,61. Izotiocyjaniany to lotne związki, o których wiadomo, że mają szerokie spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego i owadobójczego, a ich struktura, aktywność biologiczna i zawartość różnią się znacznie między gatunkami Brassicaceae42,59,62,63.
Chociaż wiadomo, że izotiocyjaniany pochodzące z mączki z nasion gorczycy mają działanie owadobójcze, brakuje danych na temat aktywności biologicznej przeciwko medycznie ważnym stawonogom. Nasze badanie zbadało aktywność larwobójczą czterech odtłuszczonych proszków z nasion przeciwko komarom Aedes. Larwy Aedes aegypti. Celem badania była ocena ich potencjalnego zastosowania jako przyjaznych dla środowiska biopestycydów do zwalczania komarów. Trzy główne składniki chemiczne mączki z nasion, izotiocyjanian allilu (AITC), izotiocyjanian benzylu (BITC) i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanian (4-HBITC) zostały również przetestowane w celu sprawdzenia aktywności biologicznej tych składników chemicznych na larwy komarów. Jest to pierwszy raport oceniający skuteczność czterech proszków z nasion kapusty i ich głównych składników chemicznych przeciwko larwom komarów.
Kolonie laboratoryjne Aedes aegypti (szczep Rockefeller) utrzymywano w temperaturze 26°C, wilgotności względnej (RH) 70% i 10:14 h (fotoperiod L:D). Pokryte samice umieszczono w plastikowych klatkach (wysokość 11 cm i średnica 9,5 cm) i karmiono za pomocą systemu karmienia butelką z cytrynianem krwi bydlęcej (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, Kalifornia, USA). Karmienie krwią prowadzono jak zwykle, używając wielowarstwowego podajnika szklanego (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, New Jersey, USA) podłączonego do rurki z krążącą wodą (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) z kontrolą temperatury 37°C. Na dno każdej szklanej komory zasilającej (powierzchnia 154 mm2) naciągnij folię Parafilm M. Następnie każdy podajnik umieszczono na górnej siatce przykrywającej klatkę z kopulującą samicą. Około 350–400 μl krwi bydlęcej dodano do szklanego lejka za pomocą pipety Pasteura (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), a dorosłe robaki pozostawiono do odcieknięcia na co najmniej godzinę. Następnie ciężarnym samicom podano 10% roztwór sacharozy i pozwolono im złożyć jaja na wilgotnym papierze filtracyjnym wyłożonym w pojedynczych ultra-przezroczystych kubeczkach do sufletów (rozmiar 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). klatkę z wodą. Umieść papier filtracyjny zawierający jaja w szczelnym worku (SC Johnsons, Racine, WI) i przechowuj w temperaturze 26°C. Jaja wykluły się i około 200–250 larw wyhodowano w plastikowych tackach zawierających mieszankę karmy dla królików (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) i proszku wątrobowego (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA). i filetu rybnego (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Niemcy) w stosunku 2:1:1. W naszych biotestach wykorzystaliśmy larwy w późnej trzeciej fazie rozwoju.
Materiał nasion roślin użyty w tym badaniu został uzyskany z następujących źródeł komercyjnych i rządowych: Brassica juncea (gorczyca brązowa-Pacific Gold) i Brassica juncea (gorczyca biała-Ida Gold) z Pacific Northwest Farmers' Cooperative, stan Waszyngton, USA; (rzeżucha ogrodowa) z Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, USA i Thlaspi arvense (rzeżucha polna-Elisabeth) z USDA-ARS, Peoria, IL, USA; Żadne z nasion użytych w badaniu nie zostało potraktowane pestycydami. Cały materiał nasion został przetworzony i użyty w tym badaniu zgodnie z lokalnymi i krajowymi przepisami oraz zgodnie ze wszystkimi stosownymi lokalnymi i krajowymi przepisami. W tym badaniu nie badano odmian roślin transgenicznych.
Nasiona Brassica juncea (PG), Lucerny (Ls), gorczycy białej (IG), Thlaspi arvense (DFP) zmielono na drobny proszek przy użyciu młyna ultracentrifugalnego Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Niemcy) wyposażonego w sitko o oczkach 0,75 mm i wirnik ze stali nierdzewnej, 12 zębów, 10 000 obr./min (Tabela 1). Zmielony proszek nasion przeniesiono do papierowego gilzy i odtłuszczono heksanem w aparacie Soxhleta przez 24 godziny. Podpróbkę odtłuszczonej gorczycy polnej poddano obróbce cieplnej w temperaturze 100 °C przez 1 godzinę w celu denaturacji mirozynazy i zapobieżenia hydrolizie glukozynolanów w celu utworzenia biologicznie aktywnych izotiocyjanianów. Poddany obróbce cieplnej proszek nasion skrzypu polnego (DFP-HT) zastosowano jako kontrolę negatywną poprzez denaturację mirozynazy.
Zawartość glukozynolanów w odtłuszczonej mączce nasiennej oznaczano trzykrotnie przy użyciu chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC) zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem64. W skrócie, do 250 mg próbki odtłuszczonego proszku nasiennego dodano 3 ml metanolu. Każdą próbkę poddano działaniu ultradźwięków w łaźni wodnej przez 30 minut i pozostawiono w ciemności w temperaturze 23°C na 16 godzin. Następnie 1 ml alikwot warstwy organicznej przefiltrowano przez filtr 0,45 μm do automatycznego próbnika. Korzystając z systemu Shimadzu HPLC (dwie pompy LC 20AD; automatyczny próbnik SIL 20A; odgazowywacz DGU 20As; detektor SPD-20A UV-VIS do monitorowania przy 237 nm; i moduł magistrali komunikacyjnej CBM-20A), zawartość glukozynolanów w mączce nasiennej oznaczano trzykrotnie. przy użyciu oprogramowania Shimadzu LC Solution w wersji 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). Kolumna była kolumną fazy odwróconej C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Początkowe warunki fazy ruchomej ustawiono na 12% metanolu/88% 0,01 M wodorotlenku tetrabutyloamoniowego w wodzie (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ze szybkością przepływu 1 ml/min. Po wstrzyknięciu 15 μl próbki początkowe warunki utrzymywano przez 20 minut, a następnie stosunek rozpuszczalnika dostosowano do 100% metanolu, przy całkowitym czasie analizy próbki wynoszącym 65 minut. Krzywą standardową (opartą na nM/mAb) wygenerowano poprzez seryjne rozcieńczenia świeżo przygotowanych standardów synapiny, glukozynolanów i mirozyny (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) w celu oszacowania zawartości siarki w odtłuszczonej mączce nasiennej. glukozynolanów. Stężenia glukozynolanów w próbkach badano na aparacie Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, USA) przy użyciu wersji OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) wyposażonej w tę samą kolumnę i przy użyciu wcześniej opisanej metody. Stężenia glukozynolanów określono; mogą być porównywalne między systemami HPLC.
Allyl isothiocyanate (94%, stabilny) i benzyl isothiocyanate (98%) zakupiono od Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 4-Hydroxybenzylisothiocyanate zakupiono od ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Po enzymatycznej hydrolizie przez mirozynazę glukozynolany, glukozynolany i glukozynolany tworzą allyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate i 4-hydroxybenzylisothiocyanate.
Badania laboratoryjne w zakresie biochemii przeprowadzono zgodnie z metodą Muturi et al. 32 ze zmianami. W badaniu wykorzystano pięć niskotłuszczowych pasz nasiennych: DFP, DFP-HT, IG, PG i Ls. Dwadzieścia larw umieszczono w 400 ml jednorazowego trójdrożnego zlewki (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) zawierającej 120 ml dejonizowanej wody (dH2O). Przebadano siedem stężeń mączki nasiennej pod kątem toksyczności dla larw komarów: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 i 0,12 g mączki nasiennej/120 ml dH2O dla mączki nasiennej DFP, DFP-HT, IG i PG. Wstępne badania biologiczne wskazują, że odtłuszczona mączka nasienna Ls jest bardziej toksyczna niż cztery inne testowane mąki nasienne. W związku z tym dostosowaliśmy siedem stężeń mączki nasiennej Ls do następujących stężeń: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 i 0,075 g/120 ml dH2O.
Nieleczona grupa kontrolna (dH20, bez dodatku mączki nasiennej) została włączona do oceny normalnej śmiertelności owadów w warunkach badania. Toksykologiczne biotesty dla każdej mączki nasiennej obejmowały trzy powtórzone trójskośne zlewki (20 późnych larw trzeciej fazy na zlewkę), łącznie 108 fiolek. Leczone pojemniki przechowywano w temperaturze pokojowej (20-21°C), a śmiertelność larw rejestrowano podczas 24 i 72 godzin ciągłej ekspozycji na stężenia lecznicze. Jeśli ciało i przydatki komara nie poruszają się po przebiciu lub dotknięciu cienką szpatułką ze stali nierdzewnej, larwy komara uważa się za martwe. Martwe larwy zwykle pozostają nieruchome w pozycji grzbietowej lub brzusznej na dnie pojemnika lub na powierzchni wody. Eksperyment powtórzono trzy razy w różne dni, używając różnych grup larw, łącznie 180 larw wystawionych na każde stężenie lecznicze.
Toksyczność AITC, BITC i 4-HBITC dla larw komarów oceniano przy użyciu tej samej procedury biotestu, ale z różnymi metodami leczenia. Przygotuj 100 000 ppm roztworów macierzystych dla każdej substancji chemicznej, dodając 100 µl substancji chemicznej do 900 µl absolutnego etanolu w 2-ml probówce wirówkowej i potrząsając przez 30 sekund, aby dokładnie wymieszać. Stężenia w leczeniu określono na podstawie naszych wstępnych biotestów, które wykazały, że BITC jest znacznie bardziej toksyczny niż AITC i 4-HBITC. Aby określić toksyczność, 5 stężeń BITC (1, 3, 6, 9 i 12 ppm), 7 stężeń AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm) i 6 stężeń 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm). Do kontrolnego zabiegu wstrzyknięto 108 μl absolutnego etanolu, co odpowiada maksymalnej objętości zabiegu chemicznego. Biotesty powtórzono jak powyżej, eksponując łącznie 180 larw na stężenie zabiegu. Śmiertelność larw rejestrowano dla każdego stężenia AITC, BITC i 4-HBITC po 24 godzinach ciągłego narażenia.
Analiza probitowa 65 danych dotyczących śmiertelności związanej z dawką została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Polo (Polo Plus, LeOra Software, wersja 1.0) w celu obliczenia 50% stężenia śmiertelnego (LC50), 90% stężenia śmiertelnego (LC90), nachylenia, współczynnika dawki śmiertelnej i 95% stężenia śmiertelnego. na podstawie przedziałów ufności dla współczynników dawek śmiertelnych dla przekształconych logarytmicznie krzywych stężenia i krzywych dawka-śmiertelność. Dane dotyczące śmiertelności są oparte na połączonych danych replikacyjnych 180 larw narażonych na każde stężenie lecznicze. Analizy probabilistyczne zostały przeprowadzone oddzielnie dla każdej mączki nasiennej i każdego składnika chemicznego. Na podstawie 95% przedziału ufności współczynnika dawki śmiertelnej, toksyczność mączki nasiennej i składników chemicznych dla larw komarów uznano za istotnie różną, więc przedział ufności zawierający wartość 1 nie był istotnie różny, P = 0,0566.
Wyniki HPLC dla określenia głównych glukozynolanów w odtłuszczonych mąkach nasiennych DFP, IG, PG i Ls są wymienione w Tabeli 1. Główne glukozynolany w badanych mąkach nasiennych były różne, z wyjątkiem DFP i PG, które zawierały glukozynolany mirozynazy. Zawartość mirozyny w PG była wyższa niż w DFP, odpowiednio 33,3 ± 1,5 i 26,5 ± 0,9 mg/g. Proszek z nasion Ls zawierał 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikonu, podczas gdy proszek z nasion IG zawierał 38,0 ± 0,5 mg/g synapiny.
Larwy komarów Ae. Aedes aegypti zostały zabite po zastosowaniu odtłuszczonej mączki nasiennej, chociaż skuteczność zabiegu różniła się w zależności od gatunku rośliny. Tylko DFP-NT nie był toksyczny dla larw komarów po 24 i 72 godzinach narażenia (Tabela 2). Toksyczność aktywnego proszku nasiennego wzrastała wraz ze wzrostem stężenia (Ryc. 1A, B). Toksyczność mączki nasiennej dla larw komarów różniła się istotnie na podstawie 95% CI stosunku dawki śmiertelnej wartości LC50 w ocenach po 24 i 72 godzinach (Tabela 3). Po 24 godzinach toksyczny efekt mączki nasiennej Ls był większy niż innych zabiegów z użyciem mączki nasiennej, przy najwyższej aktywności i maksymalnej toksyczności dla larw (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larwy były mniej wrażliwe na DFP po 24 godzinach w porównaniu do zabiegów z proszkiem nasion IG, Ls i PG, przy wartościach LC50 wynoszących odpowiednio 0,115, 0,04 i 0,08 g/120 ml dH2O, które były statystycznie wyższe od wartości LC50. 0,211 g/120 ml dH2O (Tabela 3). Wartości LC90 DFP, IG, PG i Ls wynosiły odpowiednio 0,376, 0,275, 0,137 i 0,074 g/120 ml dH2O (Tabela 2). Najwyższe stężenie DPP wynosiło 0,12 g/120 ml dH2O. Po 24 godzinach oceny średnia śmiertelność larw wyniosła zaledwie 12%, podczas gdy średnia śmiertelność larw IG i PG osiągnęła odpowiednio 51% i 82%. Po 24 godzinach oceny średnia śmiertelność larw w przypadku najwyższego stężenia mączki nasiennej Ls (0,075 g/120 ml dH2O) wyniosła 99% (ryc. 1A).
Krzywe śmiertelności oszacowano na podstawie odpowiedzi na dawkę (Probit) larw Ae. Egyptian (larwy 3. stadium) na stężenie mączki nasiennej 24 godziny (A) i 72 godziny (B) po zabiegu. Linia przerywana przedstawia LC50 zabiegu mączką nasienną. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense inaktywowane ciepłem, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
W 72-godzinnej ocenie wartości LC50 mączki nasiennej DFP, IG i PG wynosiły odpowiednio 0,111, 0,085 i 0,051 g/120 ml dH2O. Prawie wszystkie larwy wystawione na mączkę nasienną Ls padły po 72 godzinach ekspozycji, więc dane dotyczące śmiertelności były niezgodne z analizą probitową. W porównaniu z innymi mączkami nasiennymi larwy były mniej wrażliwe na obróbkę mączką nasienną DFP i miały statystycznie wyższe wartości LC50 (tabele 2 i 3). Po 72 godzinach wartości LC50 dla obróbek mączką nasienną DFP, IG i PG oszacowano odpowiednio na 0,111, 0,085 i 0,05 g/120 ml dH2O. Po 72 godzinach oceny wartości LC90 proszków nasion DFP, IG i PG wynosiły odpowiednio 0,215, 0,254 i 0,138 g/120 ml dH2O. Po 72 godzinach oceny średnia śmiertelność larw w przypadku zabiegów z użyciem mączki nasion DFP, IG i PG przy maksymalnym stężeniu 0,12 g/120 ml dH2O wynosiła odpowiednio 58%, 66% i 96% (rys. 1B). Po 72 godzinach oceny stwierdzono, że mączka nasion PG jest bardziej toksyczna niż mączka nasion IG i DFP.
Syntetyczne izotiocyjaniany, izotiocyjanian allilu (AITC), izotiocyjanian benzylu (BITC) i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanian (4-HBITC) mogą skutecznie zabijać larwy komarów. Po 24 godzinach od zabiegu BITC był bardziej toksyczny dla larw, przy wartości LC50 wynoszącej 5,29 ppm w porównaniu do 19,35 ppm dla AITC i 55,41 ppm dla 4-HBITC (Tabela 4). W porównaniu do AITC i BITC, 4-HBITC ma niższą toksyczność i wyższą wartość LC50. Istnieją znaczące różnice w toksyczności dla larw komarów dwóch głównych izotiocyjanianów (Ls i PG) w najsilniejszej mączce nasiennej. Toksyczność oparta na śmiertelnej dawce stosunku wartości LC50 między AITC, BITC i 4-HBITC wykazała różnicę statystyczną, tak że 95% CI śmiertelnej dawki stosunku LC50 nie obejmowało wartości 1 (P = 0,05, tabela 4). Oszacowano, że najwyższe stężenia zarówno BITC, jak i AITC zabijają 100% badanych larw (rysunek 2).
Krzywe śmiertelności oszacowano na podstawie odpowiedzi na dawkę (Probit) Ae. 24 godziny po leczeniu larwy egipskie (larwy 3. stadium) osiągnęły stężenia syntetycznego izotiocyjanianu. Linia przerywana przedstawia LC50 dla leczenia izotiocyjanianem. Izotiocyjanian benzylu BITC, izotiocyjanian allilu AITC i 4-HBITC.
Zastosowanie biopestycydów roślinnych jako środków kontroli wektorów komarów jest od dawna badane. Wiele roślin wytwarza naturalne substancje chemiczne o działaniu owadobójczym37. Ich związki bioaktywne stanowią atrakcyjną alternatywę dla syntetycznych insektycydów o dużym potencjale w zwalczaniu szkodników, w tym komarów.
Rośliny gorczycy są uprawiane jako roślina uprawna dla ich nasion, używanych jako przyprawa i źródło oleju. Kiedy olej gorczycowy jest ekstrahowany z nasion lub kiedy musztarda jest ekstrahowana w celu wykorzystania jako biopaliwo,69 produktem ubocznym jest odtłuszczona mączka z nasion. Ta mączka z nasion zachowuje wiele swoich naturalnych składników biochemicznych i enzymów hydrolitycznych. Toksyczność tej mączki z nasion przypisuje się produkcji izotiocyjanianów55,60,61. Izotiocyjaniany powstają w wyniku hydrolizy glukozynolanów przez enzym mirozynazę podczas hydratacji mączki z nasion38,55,70 i wiadomo, że mają działanie grzybobójcze, bakteriobójcze, nicieniobójcze i owadobójcze, a także inne właściwości, w tym chemiczne efekty sensoryczne i właściwości chemioterapeutyczne61,62,70. Kilka badań wykazało, że rośliny gorczycy i mączka z nasion działają skutecznie jako środki fumigacyjne przeciwko szkodnikom gleby i przechowywanej żywności57,59,71,72. W tym badaniu oceniliśmy toksyczność mączki z czterech nasion i jej trzech bioaktywnych produktów AITC, BITC i 4-HBITC dla larw komarów Aedes. Aedes aegypti. Oczekuje się, że dodanie mączki z nasion bezpośrednio do wody zawierającej larwy komarów aktywuje procesy enzymatyczne, które wytwarzają izotiocyjaniany toksyczne dla larw komarów. Ta biotransformacja została częściowo zademonstrowana przez obserwowaną aktywność larwicydową mączki z nasion i utratę aktywności owadobójczej, gdy mączka z nasion gorczycy karłowatej została poddana obróbce cieplnej przed użyciem. Oczekuje się, że obróbka cieplna zniszczy enzymy hydrolityczne, które aktywują glukozynolany, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się bioaktywnych izotiocyjanianów. Jest to pierwsze badanie potwierdzające właściwości owadobójcze proszku z nasion kapusty przeciwko komarom w środowisku wodnym.
Spośród testowanych proszków nasiennych, proszek z nasion rzeżuchy (Ls) był najbardziej toksyczny, powodując wysoką śmiertelność Aedes albopictus. Larwy Aedes aegypti były przetwarzane nieprzerwanie przez 24 godziny. Pozostałe trzy proszki nasienne (PG, IG i DFP) miały wolniejszą aktywność i nadal powodowały znaczną śmiertelność po 72 godzinach ciągłego przetwarzania. Tylko mączka z nasion Ls zawierała znaczące ilości glukozynolanów, podczas gdy PG i DFP zawierały mirozynazę, a IG zawierała glukozynolan jako główny glukozynolan (Tabela 1). Glukotropeolina jest hydrolizowana do BITC, a sinalbina jest hydrolizowana do 4-HBITC61,62. Wyniki naszych biotestów wskazują, że zarówno mączka z nasion Ls, jak i syntetyczny BITC są wysoce toksyczne dla larw komarów. Głównym składnikiem mączki z nasion PG i DFP jest mirozynaza glukozynolan, który jest hydrolizowany do AITC. AITC jest skuteczny w zabijaniu larw komarów z wartością LC50 wynoszącą 19,35 ppm. W porównaniu do AITC i BITC, izotiocyjanian 4-HBITC jest najmniej toksyczny dla larw. Chociaż AITC jest mniej toksyczny niż BITC, ich wartości LC50 są niższe niż wielu olejków eterycznych testowanych na larwach komarów32,73,74,75.
Nasz proszek z nasion roślin krzyżowych do stosowania przeciwko larwom komarów zawiera jeden główny glukozynolan, stanowiący ponad 98-99% całkowitych glukozynolanów, jak określono metodą HPLC. Wykryto śladowe ilości innych glukozynolanów, ale ich poziom był mniejszy niż 0,3% całkowitych glukozynolanów. Proszek z nasion rzeżuchy (L. sativum) zawiera wtórne glukozynolany (sinigrynę), ale ich udział wynosi 1% całkowitych glukozynolanów, a ich zawartość jest nadal nieistotna (około 0,4 mg/g proszku z nasion). Chociaż PG i DFP zawierają ten sam główny glukozynolan (mirozynę), aktywność larwobójcza ich mączek nasiennych różni się znacząco ze względu na ich wartości LC50. Różni się toksycznością dla mączniaka prawdziwego. Pojawienie się larw Aedes aegypti może być spowodowane różnicami w aktywności mirozynazy lub stabilności między dwoma rodzajami nasion. Aktywność mirozynazy odgrywa ważną rolę w biodostępności produktów hydrolizy, takich jak izotiocyjaniany w roślinach Brassicaceae76. Poprzednie raporty Pococka i in.77 oraz Wilkinsona i in.78 wykazały, że zmiany w aktywności i stabilności mirozynazy mogą być również związane z czynnikami genetycznymi i środowiskowymi.
Oczekiwaną zawartość bioaktywnych izotiocyjanianów obliczono na podstawie wartości LC50 każdej mączki nasiennej po 24 i 72 godzinach (Tabela 5) w celu porównania z odpowiednimi zastosowaniami chemicznymi. Po 24 godzinach izotiocyjaniany w mączce nasiennej były bardziej toksyczne niż czyste związki. Wartości LC50 obliczone na podstawie części na milion (ppm) zapraw nasiennych izotiocyjanianowych były niższe niż wartości LC50 dla zastosowań BITC, AITC i 4-HBITC. Obserwowaliśmy larwy spożywające peletki mączki nasiennej (Rysunek 3A). W konsekwencji larwy mogą być narażone na bardziej skoncentrowane działanie toksycznych izotiocyjanianów poprzez spożywanie peletki mączki nasiennej. Było to najbardziej widoczne w przypadku zapraw nasiennych IG i PG po 24-godzinnej ekspozycji, gdzie stężenia LC50 były odpowiednio o 75% i 72% niższe niż w przypadku czystych zapraw AITC i 4-HBITC. Zabiegi Ls i DFP były bardziej toksyczne niż czysty izotiocyjanian, przy wartościach LC50 odpowiednio o 24% i 41% niższych. Larwy w zabiegu kontrolnym pomyślnie przepoczwarzyły się (rys. 3B), podczas gdy większość larw w zabiegu z mączką nasienną nie przepoczwarzyła się, a rozwój larw był znacznie opóźniony (rys. 3B,D). U Spodopteralitura izotiocyjaniany są związane z zahamowaniem wzrostu i opóźnieniem rozwoju79.
Larwy komarów Ae. Aedes aegypti były nieprzerwanie wystawione na działanie proszku z nasion kapusty przez 24–72 godziny. (A) Martwe larwy z cząstkami mączki nasiennej w aparacie gębowym (zakreślone kółkiem); (B) Kontrolne traktowanie (dH2O bez dodatku mączki nasiennej) wykazuje, że larwy rosną normalnie i zaczynają się przepoczwarzać po 72 godzinach (C, D) Larwy traktowane mączką nasienną; mączka nasienna wykazywała różnice w rozwoju i nie przepoczwarzała się.
Nie badaliśmy mechanizmu toksycznego działania izotiocyjanianów na larwy komarów. Jednak poprzednie badania na mrówkach ognistych (Solenopsis invicta) wykazały, że hamowanie glutationu S-transferazy (GST) i esterazy (EST) jest głównym mechanizmem bioaktywności izotiocyjanianów, a AITC, nawet przy niskiej aktywności, może również hamować aktywność GST. czerwonych mrówek ognistych w niskich stężeniach. Dawka wynosi 0,5 µg/ml80. Natomiast AITC hamuje acetylocholinoesterazę u dorosłych ryjkowców kukurydzianych (Sitophilus zeamais)81. Podobne badania muszą zostać przeprowadzone w celu wyjaśnienia mechanizmu aktywności izotiocyjanianów u larw komarów.
Stosujemy inaktywowaną cieplnie obróbkę DFP, aby poprzeć propozycję, że hydroliza roślinnych glukozynolanów w celu utworzenia reaktywnych izotiocyjanianów służy jako mechanizm kontroli larw komarów przez mączkę z nasion gorczycy. Mączka z nasion DFP-HT nie była toksyczna przy testowanych dawkach aplikacji. Lafarga i in. 82 podali, że glukozynolany są wrażliwe na degradację w wysokich temperaturach. Oczekuje się również, że obróbka cieplna denaturuje enzym mirozynazy w mączce z nasion i zapobiega hydrolizie glukozynolanów w celu utworzenia reaktywnych izotiocyjanianów. Potwierdzili to również Okunade i in. 75 wykazali, że mirozynaza jest wrażliwa na temperaturę, pokazując, że aktywność mirozynazy została całkowicie inaktywowana, gdy nasiona gorczycy, gorczycy czarnej i krwawnika były wystawione na działanie temperatur powyżej 80° C. Mechanizmy te mogą powodować utratę aktywności owadobójczej mączki z nasion DFP poddanej obróbce cieplnej.
Zatem mączka z nasion gorczycy i jej trzy główne izotiocyjaniany są toksyczne dla larw komarów. Biorąc pod uwagę te różnice między mączką z nasion a zabiegami chemicznymi, stosowanie mączki z nasion może być skuteczną metodą zwalczania komarów. Istnieje potrzeba zidentyfikowania odpowiednich formulacji i skutecznych systemów dostarczania w celu poprawy skuteczności i stabilności stosowania proszków z nasion. Nasze wyniki wskazują na potencjalne zastosowanie mączki z nasion gorczycy jako alternatywy dla syntetycznych pestycydów. Ta technologia może stać się innowacyjnym narzędziem do zwalczania komarów będących wektorami. Ponieważ larwy komarów rozwijają się w środowiskach wodnych, a glukozynolany mączki z nasion są enzymatycznie przekształcane w aktywne izotiocyjaniany po uwodnieniu, stosowanie mączki z nasion gorczycy w wodzie zakażonej komarami oferuje znaczny potencjał kontrolny. Chociaż aktywność larwicydowa izotiocyjanianów jest różna (BITC > AITC > 4-HBITC), potrzebne są dalsze badania, aby ustalić, czy łączenie mączki z nasion z wieloma glukozynolanami synergicznie zwiększa toksyczność. To pierwsze badanie, które wykazało owadobójcze działanie odtłuszczonej mączki z nasion roślin krzyżowych i trzech bioaktywnych izotiocyjanianów na komary. Wyniki tego badania otwierają nowe możliwości, pokazując, że odtłuszczona mączka z nasion kapusty, produkt uboczny ekstrakcji oleju z nasion, może służyć jako obiecujący środek larwicydowy do zwalczania komarów. Informacje te mogą pomóc w dalszym odkrywaniu roślinnych środków biokontroli i ich rozwoju jako tanich, praktycznych i przyjaznych dla środowiska biopestycydów.
Zestawy danych wygenerowane na potrzeby tego badania i wynikające z nich analizy są dostępne u autora korespondencyjnego na uzasadnione żądanie. Pod koniec badania wszystkie materiały użyte w badaniu (owady i mączka nasienna) zostały zniszczone.
Czas publikacji: 29-07-2024