Aby skuteczniekontrolować komaryAby zmniejszyć częstość występowania chorób, które przenoszą, potrzebne są strategiczne, zrównoważone i przyjazne dla środowiska alternatywy dla pestycydów chemicznych. Oceniliśmy mączki nasienne z niektórych roślin Brassicaceae (rodzina Brassica) jako źródło izotiocyjanianów pochodzenia roślinnego, wytwarzanych w wyniku enzymatycznej hydrolizy biologicznie nieaktywnych glukozynolanów, do zastosowania w zwalczaniu egipskich komarów Aedes (L., 1762). Pięcioskładnikowa mączka z nasion odtłuszczonych (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 i Thlaspi arvense – trzy główne typy inaktywacji termicznej i degradacji enzymatycznej Produkty chemiczne Określenie toksyczności (LC50) izotiocyjanianu allilu, izotiocyjanianu benzylu i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanianu dla larw Aedes aegypti przy 24-godzinnej ekspozycji = 0,04 g/120 ml dH2O). Wartości LC50 dla gorczycy, gorczycy białej i skrzypu polnego. mączka z nasion wynosiła odpowiednio 0,05, 0,08 i 0,05 w porównaniu do izotiocyjanianu allilu (LC50 = 19,35 ppm), a 4,0-hydroksybenzyloizotiocyjanian (LC50 = 55,41 ppm) był bardziej toksyczny dla larw w ciągu 24 godzin po zabiegu niż 0,1 g/120 ml dH2O. Wyniki te są zgodne z produkcją mączki z nasion lucerny. Wyższa wydajność estrów benzylowych odpowiada obliczonym wartościom LC50. Stosowanie mączki z nasion może zapewnić skuteczną metodę zwalczania komarów. Skuteczność proszku z nasion roślin krzyżowych i jego głównych składników chemicznych przeciwko larwom komarów i pokazuje, jak naturalne związki w proszku z nasion roślin krzyżowych mogą służyć jako obiecujący, przyjazny dla środowiska larwicyd do zwalczania komarów.
Choroby przenoszone przez wektory, wywoływane przez komary z rodzaju Aedes, pozostają poważnym globalnym problemem zdrowia publicznego. Częstość występowania chorób przenoszonych przez komary rozprzestrzenia się geograficznie1,2,3 i powraca, prowadząc do wybuchów ciężkich chorób4,5,6,7. Rozprzestrzenianie się chorób wśród ludzi i zwierząt (np. gorączki chikungunya, dengi, gorączki doliny Rift, żółtej febry i wirusa Zika) jest bezprecedensowe. Sama denga naraża około 3,6 miliarda ludzi na zakażenie w tropikach, a szacuje się, że rocznie odnotowuje się 390 milionów zakażeń, co powoduje 6100–24 300 zgonów rocznie8. Ponowne pojawienie się i wybuch epidemii wirusa Zika w Ameryce Południowej przyciągnęło uwagę całego świata ze względu na uszkodzenie mózgu, jakie powoduje u dzieci urodzonych przez zakażone kobiety2. Kremer i wsp.3 przewidują, że zasięg geograficzny komarów z rodzaju Aedes będzie się nadal rozszerzał i że do 2050 roku połowa światowej populacji będzie narażona na zakażenie arbowirusami przenoszonymi przez komary.
Z wyjątkiem niedawno opracowanych szczepionek przeciwko dendze i żółtej febrze, szczepionki przeciwko większości chorób przenoszonych przez komary nie zostały jeszcze opracowane9,10,11. Szczepionki są nadal dostępne w ograniczonych ilościach i są stosowane jedynie w badaniach klinicznych. Zwalczanie komarów-nosicieli za pomocą syntetycznych insektycydów jest kluczową strategią kontroli rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez komary12,13. Chociaż syntetyczne pestycydy są skuteczne w zabijaniu komarów, ich dalsze stosowanie negatywnie wpływa na organizmy niebędące celem ataku i zanieczyszcza środowisko14,15,16. Jeszcze bardziej niepokojący jest trend rosnącej oporności komarów na chemiczne insektycydy17,18,19. Problemy związane z pestycydami przyspieszyły poszukiwania skutecznych i przyjaznych dla środowiska alternatyw dla wektorów chorób.
Różne rośliny zostały opracowane jako źródła fitopestycydów do zwalczania szkodników20,21. Substancje roślinne są generalnie przyjazne dla środowiska, ponieważ są biodegradowalne i charakteryzują się niską lub znikomą toksycznością dla organizmów niebędących celem zwalczania, takich jak ssaki, ryby i płazy20,22. Wiadomo, że preparaty ziołowe wytwarzają różnorodne związki bioaktywne o różnych mechanizmach działania, skutecznie zwalczając komary w różnych stadiach ich życia23,24,25,26. Związki pochodzenia roślinnego, takie jak olejki eteryczne i inne aktywne składniki roślinne, zyskały popularność i utorowały drogę innowacyjnym narzędziom do zwalczania komarów-nosicieli. Olejki eteryczne, monoterpeny i seskwiterpeny działają jako repelenty, odstraszacze żerujące i owicydy27,28,29,30,31,32,33. Wiele olejów roślinnych powoduje śmierć larw, poczwarek i osobników dorosłych komarów34,35,36, wpływając na układ nerwowy, oddechowy, hormonalny i inne ważne układy owadów37.
Najnowsze badania dostarczyły wiedzy na temat potencjalnego wykorzystania roślin gorczycy i ich nasion jako źródła związków bioaktywnych. Mączka z nasion gorczycy została przetestowana jako biofumigant38,39,40,41 i była stosowana jako dodatek do gleby w celu tłumienia chwastów42,43,44 i zwalczania patogenów roślinnych przenoszonych przez glebę45,46,47,48,49,50, odżywiania roślin, nicieni41,51, 52, 53, 54 i szkodników55, 56, 57, 58, 59, 60. Działanie grzybobójcze tych proszków z nasion przypisuje się związkom ochronnym roślin zwanym izotiocyjanianami38,42,60. W roślinach te związki ochronne są magazynowane w komórkach roślinnych w postaci nieaktywnych biologicznie glukozynolanów. Jednakże, gdy rośliny zostaną uszkodzone przez żerowanie owadów lub infekcję patogenami, glukozynolany są hydrolizowane przez mirozynazę do bioaktywnych izotiocyjanianów55,61. Izotiocyjaniany to lotne związki chemiczne o szerokim spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego i owadobójczego, a ich struktura, aktywność biologiczna i zawartość są bardzo zróżnicowane u różnych gatunków Brassicaceae42,59,62,63.
Chociaż wiadomo, że izotiocyjaniany pochodzące z mączki z nasion gorczycy wykazują działanie owadobójcze, brakuje danych na temat ich aktywności biologicznej wobec medycznie ważnych wektorów stawonogów. W naszym badaniu zbadano aktywność larwobójczą czterech odtłuszczonych proszków z nasion kapusty w stosunku do komarów z rodzaju Aedes. Larwy komarów z gatunku Aedes aegypti. Celem badania była ocena ich potencjalnego zastosowania jako przyjaznych dla środowiska biopestycydów do zwalczania komarów. Przebadano również trzy główne składniki chemiczne mączki z nasion: izotiocyjanian allilu (AITC), izotiocyjanian benzylu (BITC) i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanian (4-HBITC), aby zbadać ich aktywność biologiczną na larwach komarów. Jest to pierwsze doniesienie oceniające skuteczność czterech proszków z nasion kapusty i ich głównych składników chemicznych w zwalczaniu larw komarów.
Kolonie laboratoryjne Aedes aegypti (szczep Rockefeller) utrzymywano w temperaturze 26°C, przy wilgotności względnej (RH) 70% i fotoperiodzie 10:14 h (L:D). Pokryte samice umieszczono w plastikowych klatkach (o wysokości 11 cm i średnicy 9,5 cm) i karmiono za pomocą systemu do karmienia butelką z cytrynianową krwią bydlęcą (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, Kalifornia, USA). Karmienie krwią prowadzono jak zwykle, używając wielowarstwowego podajnika membranowego (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, New Jersey, USA) podłączonego do rurki z cyrkulacyjną łaźnią wodną (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) z kontrolą temperatury 37°C. Na dno każdej szklanej komory zasilającej (powierzchnia 154 mm2) naciągnięto folię Parafilm M. Następnie każdy podajnik umieszczono na górnej siatce, przykrywającej klatkę z kopulującą samicą. Około 350–400 μl krwi bydlęcej dodano do szklanego lejka dozującego za pomocą pipety Pasteura (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), a dorosłe robaki pozostawiono do odsączenia na co najmniej godzinę. Następnie ciężarnym samicom podano 10% roztwór sacharozy i pozwolono im złożyć jaja na wilgotnej bibule filtracyjnej wyłożonej w indywidualnych, ultraprzezroczystych foremkach do sufletów (rozmiar 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). Klatkę z wodą. Umieścić bibułę filtracyjną z jajami w szczelnie zamkniętym worku (SC Johnsons, Racine, WI) i przechowywać w temperaturze 26°C. Jaja wylęgły się, a około 200–250 larw wyhodowano w plastikowych tackach zawierających mieszankę karmy dla królików (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) i proszku wątrobowego (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA). i filet rybny (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Niemcy) w stosunku 2:1:1. W naszych biotestach wykorzystaliśmy larwy w późnym trzecim stadium larwalnym.
Materiał siewny roślin użyty w badaniu pochodził z następujących źródeł komercyjnych i rządowych: Brassica juncea (gorczyca brunatna - Pacific Gold) i Brassica juncea (gorczyca biała - Ida Gold) z Pacific Northwest Farmers' Cooperative, stan Waszyngton, USA; (rzeżucha ogrodowa) z Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, USA oraz Thlaspi arvense (rzeżucha polna - Elisabeth) z USDA-ARS, Peoria, IL, USA; Żadne z nasion użytych w badaniu nie było traktowane pestycydami. Cały materiał siewny został przetworzony i wykorzystany w badaniu zgodnie z lokalnymi i krajowymi przepisami oraz wszystkimi odpowiednimi lokalnymi i krajowymi przepisami. W badaniu nie analizowano odmian roślin transgenicznych.
Nasiona Brassica juncea (PG), lucerny (Ls), gorczycy białej (IG) i Thlaspi arvense (DFP) zmielono na drobny proszek za pomocą młynka ultracentrifugalnego Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Niemcy) wyposażonego w sito o oczkach 0,75 mm i wirnik ze stali nierdzewnej, 12 zębów, 10 000 obr./min (Tabela 1). Zmielony proszek nasion przeniesiono do papierowej gilzy i odtłuszczono heksanem w aparacie Soxhleta przez 24 godziny. Podpróbkę odtłuszczonej gorczycy polnej poddano obróbce cieplnej w temperaturze 100°C przez 1 godzinę w celu denaturacji mirozynazy i zapobieżenia hydrolizie glukozynolanów, prowadzącej do utworzenia biologicznie aktywnych izotiocyjanianów. Obrobiony cieplnie proszek z nasion skrzypu polnego (DFP-HT) zastosowano jako kontrolę negatywną poprzez denaturację mirozynazy.
Zawartość glukozynolanów w odtłuszczonej mączce nasiennej oznaczano trzykrotnie, stosując wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem64. W skrócie, 3 ml metanolu dodano do próbki 250 mg odtłuszczonego proszku nasiennego. Każdą próbkę sonikowano w łaźni wodnej przez 30 minut i pozostawiono w ciemności w temperaturze 23°C na 16 godzin. Następnie 1 ml alikwot warstwy organicznej przefiltrowano przez filtr 0,45 μm do automatycznego próbnika. Działając na systemie Shimadzu HPLC (dwie pompy LC 20AD; automatyczny próbnik SIL 20A; odgazowywacz DGU 20As; detektor SPD-20A UV-VIS do monitorowania przy 237 nm; i moduł magistrali komunikacyjnej CBM-20A), zawartość glukozynolanów w mączce nasiennej oznaczano trzykrotnie. z użyciem oprogramowania Shimadzu LC Solution w wersji 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). Kolumna była kolumną C18 Inertsil do fazy odwróconej (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Początkowe parametry fazy ruchomej ustawiono na 12% metanolu/88% 0,01 M wodorotlenku tetrabutyloamoniowego w wodzie (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) z szybkością przepływu 1 ml/min. Po wstrzyknięciu 15 μl próbki, początkowe warunki utrzymywano przez 20 minut, a następnie stosunek rozpuszczalników dostosowano do 100% metanolu, przy całkowitym czasie analizy próbki wynoszącym 65 minut. Krzywą standardową (opartą na nM/mAb) wygenerowano poprzez seryjne rozcieńczenia świeżo przygotowanych standardów synapiny, glukozynolanów i mirozyny (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) w celu oszacowania zawartości siarki w odtłuszczonej mączce nasiennej. Stężenia glukozynolanów w próbkach badano na aparacie chromatografii cieczowej Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, USA) z wykorzystaniem oprogramowania OpenLAB CDS ChemStation w wersji (C.01.07 SR2 [255]) wyposażonego w tę samą kolumnę i stosując wcześniej opisaną metodę. Stężenia glukozynolanów określono; wyniki mogą być porównywalne między systemami HPLC.
Izotiocyjanian allilu (94%, stabilny) i izotiocyjanian benzylu (98%) zakupiono od firmy Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 4-hydroksybenzyloizotiocyjanian zakupiono od firmy ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Po enzymatycznej hydrolizie przez mirozynazę, glukozynolany, glukozynolany i glukozynolany tworzą odpowiednio izotiocyjanian allilu, izotiocyjanian benzylu i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanian.
Laboratoryjne biotesty przeprowadzono zgodnie z metodą Muturi et al. 32 z modyfikacjami. W badaniu wykorzystano pięć niskotłuszczowych pasz nasiennych: DFP, DFP-HT, IG, PG i Ls. Dwadzieścia larw umieszczono w 400 ml jednorazowej zlewce trójdrożnej (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) zawierającej 120 ml dejonizowanej wody (dH2O). Przebadano siedem stężeń mączki nasiennej pod kątem toksyczności dla larw komarów: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 i 0,12 g mączki nasiennej/120 ml dH2O dla mączki nasiennej DFP, DFP-HT, IG i PG. Wstępne biotesty wskazują, że odtłuszczona mączka nasienna Ls jest bardziej toksyczna niż cztery inne testowane mąki nasienne. W związku z tym dostosowaliśmy siedem stężeń mączki nasiennej Ls do następujących stężeń: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 i 0,075 g/120 ml dH2O.
Do oceny normalnej śmiertelności owadów w warunkach badania włączono nieleczoną grupę kontrolną (dH2O, bez dodatku mączki nasiennej). Biotesty toksykologiczne dla każdej mączki nasiennej obejmowały trzy powtórzenia w trójskośnych zlewkach (20 larw w późnym trzecim stadium larwalnym w każdej zlewce), co łącznie dało 108 fiolek. Pojemniki z preparatem przechowywano w temperaturze pokojowej (20-21°C), a śmiertelność larw rejestrowano w ciągu 24 i 72 godzin ciągłej ekspozycji na stężenia preparatu. Jeśli ciało i odnóża komara nie poruszają się po przekłuciu lub dotknięciu cienką szpatułką ze stali nierdzewnej, larwy komara uważa się za martwe. Martwe larwy zazwyczaj pozostają nieruchome w pozycji grzbietowej lub brzusznej na dnie pojemnika lub na powierzchni wody. Eksperyment powtórzono trzykrotnie w różne dni, używając różnych grup larw, co łącznie dało 180 larw wystawionych na działanie każdego stężenia preparatu.
Toksyczność AITC, BITC i 4-HBITC dla larw komarów oceniono, stosując tę samą procedurę biotestu, ale z różnymi metodami. Przygotować roztwory macierzyste o stężeniu 100 000 ppm dla każdej substancji chemicznej, dodając 100 µl substancji chemicznej do 900 µl etanolu absolutnego w 2-ml probówce wirówkowej i wstrząsając przez 30 sekund w celu dokładnego wymieszania. Stężenia substancji chemicznej określono na podstawie naszych wstępnych biotestów, które wykazały, że BITC jest znacznie bardziej toksyczny niż AITC i 4-HBITC. Aby określić toksyczność, zastosowano 5 stężeń BITC (1, 3, 6, 9 i 12 ppm), 7 stężeń AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm) oraz 6 stężeń 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm). Do próbki kontrolnej wstrzyknięto 108 μl etanolu absolutnego, co odpowiada maksymalnej objętości środka chemicznego. Biotesty powtórzono jak powyżej, eksponując łącznie 180 larw na każde stężenie środka. Śmiertelność larw rejestrowano dla każdego stężenia AITC, BITC i 4-HBITC po 24 godzinach ciągłej ekspozycji.
Przeprowadzono analizę probitową 65 danych dotyczących śmiertelności zależnej od dawki, wykorzystując oprogramowanie Polo (Polo Plus, LeOra Software, wersja 1.0) do obliczenia 50% stężenia śmiertelnego (LC50), 90% stężenia śmiertelnego (LC90), nachylenia krzywej, współczynnika dawki śmiertelnej i 95% stężenia śmiertelnego. Dane dotyczące śmiertelności oparte są na połączonych danych replikacyjnych 180 larw narażonych na każde stężenie środka. Analizy probabilistyczne przeprowadzono oddzielnie dla każdej mączki nasiennej i każdego składnika chemicznego. Na podstawie 95% przedziału ufności współczynnika dawki śmiertelnej, toksyczność mączki nasiennej i składników chemicznych dla larw komarów uznano za istotnie różną, więc przedział ufności zawierający wartość 1 nie był istotnie różny, P = 0,0566.
Wyniki HPLC oznaczania głównych glukozynolanów w odtłuszczonych mąkach z nasion DFP, IG, PG i Ls przedstawiono w Tabeli 1. Główne glukozynolany w badanych mąkach z nasion były zróżnicowane, z wyjątkiem DFP i PG, które zawierały glukozynolany mirozynazy. Zawartość mirozyny w PG była wyższa niż w DFP i wynosiła odpowiednio 33,3 ± 1,5 i 26,5 ± 0,9 mg/g. Proszek z nasion Ls zawierał 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikonu, natomiast proszek z nasion IG zawierał 38,0 ± 0,5 mg/g synapiny.
Larwy komarów Ae. Aedes aegypti zostały zabite po zastosowaniu odtłuszczonej mączki nasiennej, chociaż skuteczność zabiegu była zróżnicowana w zależności od gatunku rośliny. Tylko DFP-NT nie był toksyczny dla larw komarów po 24 i 72 godzinach ekspozycji (Tabela 2). Toksyczność aktywnego proszku nasiennego wzrastała wraz ze wzrostem stężenia (Ryc. 1A, B). Toksyczność mączki nasiennej dla larw komarów była istotnie zróżnicowana na podstawie 95% CI stosunku dawek śmiertelnych wartości LC50 po 24 i 72 godzinach oceny (Tabela 3). Po 24 godzinach toksyczny wpływ mączki nasiennej Ls był większy niż innych zabiegów z użyciem mączki nasiennej, przy najwyższej aktywności i maksymalnej toksyczności dla larw (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larwy były mniej wrażliwe na DFP po 24 godzinach w porównaniu do zabiegów z użyciem proszku nasion IG, Ls i PG, przy wartościach LC50 wynoszących odpowiednio 0,115, 0,04 i 0,08 g/120 ml dH2O, które były statystycznie wyższe od wartości LC50. 0,211 g/120 ml dH2O (Tabela 3). Wartości LC90 DFP, IG, PG i Ls wynosiły odpowiednio 0,376, 0,275, 0,137 i 0,074 g/120 ml dH2O (Tabela 2). Najwyższe stężenie DPP wynosiło 0,12 g/120 ml dH2O. Po 24 godzinach oceny średnia śmiertelność larw wyniosła zaledwie 12%, podczas gdy średnia śmiertelność larw IG i PG osiągnęła odpowiednio 51% i 82%. Po 24 godzinach oceny średnia śmiertelność larw w przypadku najwyższego stężenia mączki nasiennej Ls (0,075 g/120 ml dH2O) wyniosła 99% (ryc. 1A).
Krzywe śmiertelności oszacowano na podstawie odpowiedzi na dawkę (Probit) larw Ae. Egyptian (larwy w trzecim stadium larwalnym) na stężenie mączki nasiennej po 24 godzinach (A) i 72 godzinach (B) po zabiegu. Linia przerywana przedstawia LC50 zabiegu z mączką nasienną. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense inaktywowane termicznie, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Po 72 godzinach oceny wartości LC50 mączki nasiennej DFP, IG i PG wynosiły odpowiednio 0,111, 0,085 i 0,051 g/120 ml dH2O. Prawie wszystkie larwy wystawione na działanie mączki nasiennej Ls padły po 72 godzinach ekspozycji, więc dane dotyczące śmiertelności były niezgodne z analizą probitową. W porównaniu z innymi mączkami nasiennymi, larwy były mniej wrażliwe na obróbkę mączką nasienną DFP i miały statystycznie wyższe wartości LC50 (tabele 2 i 3). Po 72 godzinach wartości LC50 dla obróbek mączką nasienną DFP, IG i PG oszacowano odpowiednio na 0,111, 0,085 i 0,05 g/120 ml dH2O. Po 72 godzinach oceny wartości LC90 dla proszków nasiennych DFP, IG i PG wyniosły odpowiednio 0,215, 0,254 i 0,138 g/120 ml dH2O. Po 72 godzinach oceny średnia śmiertelność larw dla mączek nasiennych DFP, IG i PG o maksymalnym stężeniu 0,12 g/120 ml dH2O wyniosła odpowiednio 58%, 66% i 96% (ryc. 1B). Po 72 godzinach oceny stwierdzono, że mączka nasienna PG jest bardziej toksyczna niż mączka nasienna IG i DFP.
Syntetyczne izotiocyjaniany, izotiocyjanian allilu (AITC), izotiocyjanian benzylu (BITC) i 4-hydroksybenzyloizotiocyjanian (4-HBITC) mogą skutecznie zabijać larwy komarów. Po 24 godzinach od zastosowania preparatu BITC okazał się bardziej toksyczny dla larw, osiągając wartość LC50 5,29 ppm w porównaniu z 19,35 ppm dla AITC i 55,41 ppm dla 4-HBITC (Tabela 4). W porównaniu z AITC i BITC, 4-HBITC charakteryzuje się niższą toksycznością i wyższą wartością LC50. Istnieją istotne różnice w toksyczności dla larw komarów pomiędzy dwoma głównymi izotiocyjanianami (Ls i PG) zawartymi w najskuteczniejszej mączce nasiennej. Toksyczność oparta na stosunku dawek śmiertelnych LC50 pomiędzy AITC, BITC i 4-HBITC wykazała statystyczną różnicę, tak że 95% przedział ufności (CI) dla stosunku dawek śmiertelnych LC50 nie obejmował wartości 1 (P = 0,05, tabela 4). Szacowano, że najwyższe stężenia zarówno BITC, jak i AITC zabijały 100% badanych larw (ryc. 2).
Krzywe śmiertelności oszacowano na podstawie odpowiedzi na dawkę (Probit) Ae. Po 24 godzinach od podania leku larwy chrząszcza egipskiego (larwy trzeciego stadium larwalnego) osiągnęły stężenia syntetycznego izotiocyjanianu. Linia przerywana przedstawia LC50 dla podania izotiocyjanianu. Izotiocyjanian benzylu BITC, izotiocyjanian allilu AITC i 4-HBITC.
Zastosowanie biopestycydów roślinnych jako środków owadobójczych jest od dawna badane. Wiele roślin wytwarza naturalne związki chemiczne o działaniu owadobójczym. Ich związki bioaktywne stanowią atrakcyjną alternatywę dla syntetycznych insektycydów, oferując duży potencjał w zwalczaniu szkodników, w tym komarów.
Rośliny gorczycy są uprawiane ze względu na nasiona, wykorzystywane jako przyprawa i źródło oleju. Podczas ekstrakcji oleju gorczycowego z nasion lub gdy gorczyca jest ekstrahowana w celu wykorzystania jako biopaliwo,69 produktem ubocznym jest odtłuszczona mączka nasienna. Ta mączka nasienna zachowuje wiele naturalnych składników biochemicznych i enzymów hydrolitycznych. Toksyczność tej mączki nasiennej przypisuje się wytwarzaniu izotiocyjanianów55,60,61. Izotiocyjaniany powstają w wyniku hydrolizy glukozynolanów przez enzym mirozynazę podczas hydratacji mączki nasiennej38,55,70 i są znane ze swoich właściwości grzybobójczych, bakteriobójczych, nicieniobójczych i owadobójczych, a także innych właściwości, w tym chemicznych efektów sensorycznych i właściwości chemioterapeutycznych61,62,70. Liczne badania wykazały, że rośliny gorczycy i mączka nasienna działają skutecznie jako fumiganty przeciwko szkodnikom glebowym i przechowywanym w żywności57,59,71,72. W niniejszym badaniu oceniliśmy toksyczność mączki z nasion czterech nasion i jej trzech bioaktywnych produktów: AITC, BITC i 4-HBITC, dla larw komarów z gatunku Aedes aegypti. Oczekuje się, że dodanie mączki z nasion bezpośrednio do wody zawierającej larwy komarów aktywuje procesy enzymatyczne, które wytwarzają izotiocyjaniany toksyczne dla larw komarów. Tę biotransformację wykazano częściowo poprzez obserwowaną aktywność larwobójczą mączki z nasion i utratę aktywności owadobójczej po poddaniu mączki z nasion gorczycy karłowatej obróbce cieplnej przed użyciem. Oczekuje się, że obróbka cieplna zniszczy enzymy hydrolityczne, które aktywują glukozynolany, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się bioaktywnych izotiocyjanianów. Jest to pierwsze badanie potwierdzające owadobójcze właściwości proszku z nasion kapusty przeciwko komarom w środowisku wodnym.
Spośród testowanych proszków nasiennych, proszek z nasion rzeżuchy (Ls) okazał się najbardziej toksyczny, powodując wysoką śmiertelność Aedes albopictus. Larwy Aedes aegypti poddawano ciągłej obróbce przez 24 godziny. Pozostałe trzy proszki nasienne (PG, IG i DFP) wykazywały wolniejszą aktywność i nadal powodowały znaczną śmiertelność po 72 godzinach ciągłego obróbki. Tylko mączka z nasion Ls zawierała znaczące ilości glukozynolanów, podczas gdy PG i DFP zawierały mirozynazę, a IG zawierała glukozynolan jako główny glukozynolan (Tabela 1). Glukotropeolina jest hydrolizowana do BITC, a sinalbina jest hydrolizowana do 4-HBITC61,62. Wyniki naszych biotestów wskazują, że zarówno mączka z nasion Ls, jak i syntetyczny BITC są wysoce toksyczne dla larw komarów. Głównym składnikiem mączki z nasion PG i DFP jest glukozynolan mirozynazy, który jest hydrolizowany do AITC. AITC jest skuteczny w zabijaniu larw komarów, a jego wartość LC50 wynosi 19,35 ppm. W porównaniu z AITC i BITC, izotiocyjanian 4-HBITC jest najmniej toksyczny dla larw. Chociaż AITC jest mniej toksyczny niż BITC, jego wartości LC50 są niższe niż w przypadku wielu olejków eterycznych testowanych na larwach komarów32,73,74,75.
Nasz proszek z nasion roślin krzyżowych, stosowany przeciwko larwom komarów, zawiera jeden główny glukozynolan, stanowiący ponad 98-99% całkowitej zawartości glukozynolanów, co określono metodą HPLC. Wykryto śladowe ilości innych glukozynolanów, ale ich poziom wynosił mniej niż 0,3% całkowitej zawartości glukozynolanów. Proszek z nasion rzeżuchy (L. sativum) zawiera drugorzędne glukozynolany (sinigrynę), ale ich udział w całkowitej zawartości glukozynolanów wynosi 1%, a ich zawartość jest nadal nieznaczna (około 0,4 mg/g proszku z nasion). Chociaż PG i DFP zawierają ten sam główny glukozynolan (mirozynę), aktywność larwobójcza ich mączek nasiennych różni się znacząco ze względu na ich wartości LC50. Toksyczność dla mączniaka prawdziwego jest zróżnicowana. Pojawienie się larw Aedes aegypti może być spowodowane różnicami w aktywności mirozynazy lub stabilności pomiędzy dwoma rodzajami nasion. Aktywność mirozynazy odgrywa ważną rolę w biodostępności produktów hydrolizy, takich jak izotiocyjaniany, w roślinach Brassicaceae76. Wcześniejsze doniesienia Pococka i in.77 oraz Wilkinsona i in.78 wykazały, że zmiany w aktywności i stabilności mirozynazy mogą być również związane z czynnikami genetycznymi i środowiskowymi.
Oczekiwaną zawartość bioaktywnych izotiocyjanianów obliczono na podstawie wartości LC50 każdej mączki nasiennej po 24 i 72 godzinach (Tabela 5) w celu porównania z odpowiadającymi im zastosowaniami chemicznymi. Po 24 godzinach izotiocyjaniany w mączce nasiennej były bardziej toksyczne niż czyste związki. Wartości LC50 obliczone na podstawie części na milion (ppm) izotiocyjanianów w zaprawach nasiennych były niższe niż wartości LC50 dla zastosowań BITC, AITC i 4-HBITC. Zaobserwowaliśmy larwy spożywające granulki mączki nasiennej (Rysunek 3A). W związku z tym larwy mogą być narażone na bardziej skoncentrowane działanie toksycznych izotiocyjanianów poprzez spożywanie granulek mączki nasiennej. Było to najbardziej widoczne w przypadku zapraw z mączką nasienną IG i PG po 24 godzinach ekspozycji, gdzie stężenia LC50 były odpowiednio o 75% i 72% niższe niż w przypadku zapraw z czystym AITC i 4-HBITC. Zabiegi z użyciem Ls i DFP były bardziej toksyczne niż czysty izotiocyjanian, z wartościami LC50 odpowiednio o 24% i 41% niższymi. Larwy w grupie kontrolnej pomyślnie przepoczwarzyły się (ryc. 3B), podczas gdy większość larw w grupie z mączką nasienną nie przepoczwarzyła się, a rozwój larw był znacznie opóźniony (ryc. 3B, D). U Spodopteralitura izotiocyjaniany są związane z zahamowaniem wzrostu i opóźnieniem rozwoju79.
Larwy komarów Ae. Aedes aegypti były stale wystawione na działanie proszku z nasion roślin kapustnych przez 24–72 godziny. (A) Martwe larwy z cząstkami mączki nasiennej w aparatach gębowych (zakreślone kółkiem); (B) Kontrolne traktowanie (dH2O bez dodatku mączki nasiennej) wykazuje, że larwy rosną normalnie i zaczynają się przepoczwarzać po 72 godzinach (C, D) Larwy traktowane mączką nasienną; mączka nasienna wykazywała różnice w rozwoju i nie przepoczwarzała się.
Nie badaliśmy mechanizmu toksycznego działania izotiocyjanianów na larwy komarów. Jednak wcześniejsze badania na mrówkach ognistych (Solenopsis invicta) wykazały, że hamowanie S-transferazy glutationowej (GST) i esterazy (EST) jest głównym mechanizmem bioaktywności izotiocyjanianów, a AITC, nawet przy niskiej aktywności, może również hamować aktywność GST. [Zdanie to jest niekompletne i wymaga kontekstu, aby je poprawnie przetłumaczyć] u mrówek ognistych importowanych w niskich stężeniach. Dawka wynosi 0,5 µg/ml80. Natomiast AITC hamuje acetylocholinoesterazę u dorosłych ryjkowców kukurydzianych (Sitophilus zeamais)81. Konieczne jest przeprowadzenie podobnych badań w celu wyjaśnienia mechanizmu działania izotiocyjanianów u larw komarów.
Zastosowaliśmy inaktywowaną cieplnie obróbkę DFP, aby poprzeć hipotezę, że hydroliza glukozynolanów roślinnych do reaktywnych izotiocyjanianów służy jako mechanizm zwalczania larw komarów przez mączkę z nasion gorczycy. Mączka z nasion DFP-HT nie była toksyczna w testowanych dawkach. Lafarga i in. 82 donieśli, że glukozynolany są wrażliwe na degradację w wysokich temperaturach. Oczekuje się również, że obróbka cieplna denaturuje enzym mirozynazę w mączce z nasion i zapobiega hydrolizie glukozynolanów do reaktywnych izotiocyjanianów. Potwierdzili to również Okunade i in. 75, którzy wykazali, że mirozynaza jest wrażliwa na temperaturę, wykazując, że aktywność mirozynazy została całkowicie inaktywowana, gdy nasiona gorczycy, gorczycy czarnej i krwawnika były wystawione na działanie temperatur powyżej 80°C. Mechanizmy te mogą prowadzić do utraty aktywności owadobójczej mączki z nasion DFP poddanej obróbce cieplnej.
Zatem mączka z nasion gorczycy i jej trzy główne izotiocyjaniany są toksyczne dla larw komarów. Biorąc pod uwagę te różnice między mączką z nasion a środkami chemicznymi, stosowanie mączki z nasion może być skuteczną metodą zwalczania komarów. Istnieje potrzeba zidentyfikowania odpowiednich formulacji i efektywnych systemów dostarczania, aby poprawić skuteczność i stabilność stosowania proszków z nasion. Nasze wyniki wskazują na potencjalne zastosowanie mączki z nasion gorczycy jako alternatywy dla syntetycznych pestycydów. Technologia ta może stać się innowacyjnym narzędziem w zwalczaniu komarów-wektorów. Ponieważ larwy komarów rozwijają się w środowisku wodnym, a glukozynolany mączki z nasion są enzymatycznie przekształcane w aktywne izotiocyjaniany po uwodnieniu, stosowanie mączki z nasion gorczycy w wodzie zakażonej komarami oferuje znaczący potencjał kontrolny. Chociaż aktywność larwobójcza izotiocyjanianów jest zróżnicowana (BITC > AITC > 4-HBITC), potrzebne są dalsze badania, aby określić, czy synergistyczne łączenie mączki z nasion z wieloma glukozynolanami zwiększa toksyczność. To pierwsze badanie wykazujące owadobójcze działanie odtłuszczonej mączki z nasion roślin krzyżowych i trzech bioaktywnych izotiocyjanianów na komary. Wyniki tego badania otwierają nowe możliwości, pokazując, że odtłuszczona mączka z nasion kapusty, produkt uboczny ekstrakcji oleju z nasion, może być obiecującym środkiem larwobójczym w zwalczaniu komarów. Informacje te mogą przyczynić się do dalszych odkryć roślinnych środków biokontroli i ich rozwoju jako tanich, praktycznych i przyjaznych dla środowiska biopestycydów.
Zestawy danych wygenerowane na potrzeby niniejszego badania oraz wynikające z nich analizy są dostępne u autora korespondencyjnego na uzasadniony wniosek. Po zakończeniu badania wszystkie materiały wykorzystane w badaniu (owady i mączka nasienna) zostały zniszczone.
Czas publikacji: 29 lipca 2024 r.